一、近场光学显微镜

光学显微镜的放大本领来源于光的波动性，而正是光的波动性阻碍了人们无限地增加放大倍数二这个规律早在1873年就由德国科学家AbbeE根据衍射理论推导出来了，而后由瑞利归纳为一个常用公式：

△x=kλ / (nsinθ)

式中△x为光学显微镜的最小分辨距离，λ为照明光的波长，n为物方折射率，θ为物镜对试样的半张角，k为常数（为0.61时表示不相干光照明；为0.77时表示相干光照明）,nsinθ称为数值孔径（NA)。由上式可见，要想提高光学显微镜的分辨本领，就必须减小照明光波长λ，或增大数值孔径NA。就增大数值孔径而言，最好的油浸式显微镜的NA也不过1.5左右，也就是说，假如使用500nm的人射波长，仅可以得到200nm的分辨率。

生命科学的发展迫切希望有一种实验显微方法，它既具有亚微米甚至纳米尺度的光学分辨本领，又可以连续监测生物大分子和细胞器微小结构的演化，且不影响生物体系的生物活性。近场光学显微镜（near-fieldscanningopticalmi-croscopyNSOM或scanningnear-fieldopticalmicroscopy,SNOM）技术的出现为解决上面的难题带来了希望。与常规光学显微镜的二维同时成像不同，这一新技术采用距试样表面仅几个纳米的探针逐点扫描成像的方法，可以在几十纳米的分辨率下同时得到试样微区的形貌和光学信息。由于背景信号强度与受激发体积中的分子数有关，减小激发和检测体积，是提高信噪比的重要措施之一，因此，采用激光光源和近场方式，可达到减小激发和检测体积的目的。

1.近场光学显微镜的基本原理

生物试样常处于水环境中，试样往往较绵软和表面起伏较大，因此，利用超高分辨的扫描隧道显微镜和原子力显微镜观察活体生物试样难度较大，而近场光学显微镜的出现，为生物试样的超高分辨观察带来了新的希望。近场光学显微技术可用于自然或接近自然环境条件下，研究生物物质分子水平的光吸收、发射、散射和偏振等光学信息。它由激光器和光纤探针构成的“局域光源”、带有超微动装置的“试样台”和由显微镜等构成的“光学放大系统”三部分组成。近场光学显微镜的结构在总体上可与传统光学显微镜的结构一一对应，但也有明显差别：照明光源的尺度和照明方法不同；成像方法不同。近场光学显微镜有三类工作模式：(1)探针只为试样提供近场局域照明激发光；(2)探针只在近场收集来自试样的光信号；(3)探针同时作照明和收集用。

2.近场光学显微镜的应用

与用电子（束）进行成像的扫描电子显微镜和利用隧道效应的扫描隧道显微镜不同，近场光学显微镜用光子（束）成像。光子不同于电子，它是玻色子，没有质量也不携带电荷，因而，很易聚焦和改变偏振，可以开展扫描电子显微镜和扫描隧道显微镜所没有的所谓主动式应用。近场光学显微镜除用于表面分析外，还可用于超分辨成像、近场光谱学、近场光电导、近场光刻／光写、近场光储存等。为适应某些特殊需要，还出现了具有特定用途的近场光学显微镜：如生物近场光学显微镜、低温近场光学显微镜、偏光近场光学显微镜、红外光近场光学显微镜、时间分拼近场光学显微镜等。

二、激光共焦扫描显微镜

生物医学及材料科学的发展对显微技术提出了更高的要求，不仅要有更高的分辨力，而且还要能对试样进行无损层析，进而能观察其三维图像。这是普通显微技术所不可能实现的。而基于共焦原理的激光共焦扫描显微技术却能满足以上要求，从而使传统的显微镜有了新的发展。共焦成像原理是由MinskyM等在20世纪50年代提出的，由于受技术条件限制，直到20世纪80年代后期，随着激光技术、计算机图像处理技术的迅速发展，才逐渐发展成性能稳定的产品。激光共焦扫描显微镜（laserconfocalscanningmicroscopy，简称LCSM）是集共焦原理、激光扫描技术和计算机图像处理技术于一体的新型显微镜，是一种典型的高新技术光电仪器。其主要优点如下：(1)既有高的横向分辨力，又有高的轴向分辨力，同时能有效抑制杂散光，具有高的对比度。(2)能通过对物体不同深度的逐层扫描，获得物体大量断层图像，既能对物体进行层析，又能构建三维立体图像。(3）容易实现高倍率。

1.基本光路及成像原理

激光共焦扫描显微镜以光学系统的共焦成像为基础，利用光扫描技术和试样扫描技术对试样进行三维动态测量。它通常由激光光源、光学显微系统、扫描聚焦系统、计算机及具有控制、三维构建、图像处理与分析功能的软件等组成。由激光器输出的激光束经透镜L1、针孔1及扩束透镜L2后，成为较均匀的准直光束，经物镜L3后会聚于物体某一点，该点反射光（或透射光，或受激辐射的荧光）又经物镜后被分束镜反射到探测光路，由会聚透镜将其聚焦于针孔2，被探侧器接收，并将其输入计算机进行存储。通过二维扫描，得到物体某一层面的二维断层图像，再经轴向扫描，得到大量断层图像，经计算机图像重构，合成三维立体图像。其扫描装置也由计算机进行控制。

激光共焦扫描显微镜关键技术包括共焦技术、扫描技术、层析技术等。在利用共焦技术进行细胞或生物体的结构分析时，其主要的信息来源是收集从细胞或生物体表层进入内部所产生的散射光信息。如果被观察试样进行了荧光着色，那么就可以收集到不同激光照射截面的荧光信息。与电子显微镜及其他光学显微技术相比，它无须进行超薄切片，即可得到具有一定厚度和不透明试样的三维图像，从而可以对活体进行动态层析观察，这正是生物、医学研究所十分希望实现的新技术。

2.应用

激光共焦扫描显微镜自诞生以来，已被广泛应用于生命科学、半导体、化学、医学领域和三维高密度存储及徽细加工的研究，是一种应用前景很好的技术平台。在基础研究方面，可用于单分子荧光光谱研究，在应用研究如生理病理研究方面，可对某个生理过程进行特异性荧光标记，利用激光共焦显微镜对其荧光信号进行检测，从而获得病变细胞与正常细胞不同的信息。还可用于活细胞二维荧光图像定量分析，例如对DNA、RNA的含量，分子扩散等一些动态过程进行定性、定量、定时、定位分析，并且可以借助三维图像重组，实现不同角度观测。