1．直接测定法

只要分析物本身发荧光，便可通过测量其荧光强度而测定其浓度。荧光强度的测量通常是采用相对测量方法，最普通的方法是采用工作曲线法，即取已知量的分析物，经过与试样溶液一样的处理后，配成一系列的标准溶液，并测定它们的荧光强度，再以荧光强度对标准溶液浓度绘制工作曲线。然后由所测得的试样溶液的荧光强度对照工作曲线以求出试样溶液中分析物的浓度。为了使不同时间所测得的工作曲线先后一致，每次测绘工作曲线时最好能采用同一种稳定的荧光物质（如荧光塑料板或某种荧光基准物质如硫酸奎宁的溶液）来校准仪器的读数。

2．间接测定法

有些分析物，或者本身不发荧光，或者因荧光量子产率太低而无法进行直接测定，便只能采用间接测定的办法。间接测定有如下几种方法可供选择：

(1)荧光衍生法

荧光衍生法是运用某种手段将自身不发荧光的分析物，转变为一种发荧光的化合物，再通过测定该化合物的荧光强度，以间接测定分析物。

根据所采用的不同的衍生手段，荧光衍生法大致可分为化学衍生法、电化学衍生法和光化学衍生法，它们分别采用化学反应、电化学反应和光化学反应，使不发荧光的分析物转化为适合于测定的、发荧光的产物。其中，化学衍生法和光化学衍生法用得较多，尤以化学衍生法用得最多。例如许多无机金属离子的荧光测定方法，就是通过使它们与某些金属赘合剂（生荧试剂）反应生成具有荧光的鳌合物之后加以测定的。

某些不发光的有机化合物，可以通过降解反应、氧化还原反应、偶联反应、缩合反应、酶催化反应或光化学反应等等办法，使它们转化为荧光物质。例如维生素B1本身不发荧光，但可在碱性溶液中用铁氰化钾等一些氧化剂将它氧化为发荧光的硫胺荧。又如利血平本身的荧光量子产率低，可通过化学衍生法使其转化为发绿黄色强荧光的氧化产物3,4一二脱氢利血平（DDHR）后加以测定。也可采用光化学衍生法，在乙酸介质中于254nm光照射下得到其光化学氧化产物DDHR。基于光化学反应和荧光检测技术相结合的光化学荧光分析法，在20世纪70年代以后有了较大的发展，在药物分析方面的应用日益广泛。

(2)荧光猝灭法

有些分析物本身虽不发荧光，但却能使某种荧光试剂的荧光发生猝灭，且荧光猝灭的程度与分析物的浓度有着定量的关系，那么，通过测量该荧光试剂荧光强度的下降程度，便可间接地测定该分析物。例如，大多数过渡金属离子与具有荧光性质的芳族配位体络合后，往往使配位体的荧光猝灭，从而可间接测定这些金属离子。

在用荧光猝灭法进行测定时，要特别注意选择合适的荧米试剂的浓度。适当减低荧光试剂的浓度时，往往有利于提高测定的灵敏度，但却会导致测定的线性范围变窄，因而荧光试剂的合适浓度，要根据实际测定的需要加以优化选择。

(3)敏化荧光法

倘若分析物不发荧光，但可以通过选择合适的荧光试剂作为能量受体，在分析物受激发后，通过能量转移的过程，将激发能传递给能量受体，使能量受体分子被激发，再通过测定能量受体所发射的荧光强度，可以对分析物进行间接测定。

3．多组分混合物的荧光分析

由于每种荧光化合物具有本身的荧光激发光谱和发射光谱，因而在测定时相应地有激发波长和发射波长两种参数可供选择，这在混合物的测定方面，有时可简单地通过选择合适的激发波长或发射波长，达到选择性地测定混合物中某种组分的目的。例如，当混合物中各个组分的荧光峰相距颇远、彼此干扰很小时，可分别在不同的发射波长测定各个组分的荧光强度。倘若混合物中各组分的荧光峰相近，彼此严重重叠，但它们的激发光谱却有显著的差别，这时可选择不同的激发波长进行测定。

目前，荧光分析在方法学和仪器方面都有了很大的发展，在选择激发波长和发射波长之后仍无法达到混合物中各组分的分别测定时，可以采用诸如同步荧光测定、导数荧光侧定、时间分辨荧光测定、相分辨荧光测定等方法来达到分别测定或同时测定的目的。