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根据色谱基础理论和影响分离的各种色谱参数讨论,按分离度和分离时间或速度两个主要指标将进一步简要说明分离操作条件优化的基本技术措施。表明影响分离度和分离时间的各种色谱参数,包括以N或H为指标,导致色谱峰扩张的各种动力学因素;与组分保留值有关的热力学因素k和a,其相对大小与固定相、流动相性质及其体积比,溶质性质及在两相的分布常数等有关。方程的重要性在于可指导多组分混合物的分离操作条件优化。人们总是企图在最短时间内获得尽可能多组分间的高分离度,即分离出尽可能多的组分。但两者在同一条件下很难同时实现,只能兼顾分离度和分析速度。
对多组分混合物的分离,通常以最难分离物质对的分离度或洗出组分数的多少及分离时间作为分离优劣的指标。分离时间决定于最后洗出组分的保留因子。但随色谱条件变化,组分洗出顺序可能变化,最难分离物质对和最后洗出组分也可能改变。通过色谱分离方程分析、初步实验数据估算,从易至难,采取各种技术手段,实现色谱分离操作条件优化。
需要指出的是现代色谱仪器大多配置具有处理色谱数据、控制色谱仪功能、分离操作条件优化的计算机及相应软件,即色谱工作站或计算机系统。基于色谱理论、色谱分离模式、色谱参数相互关系,在大量实验数据分析基础上研发的各种色谱智能化软件可指导操作条件优化,减少实验工作量。
一 色谱方法选择
根据试样物理、化学性质和分析要求选择色谱方法。各种气体、沸点500℃以下挥发性、热稳定的试样,一般采用气相色谱分析。非挥发性试样,包括有机物、无机物、高分子化合物、可解离化合物等均可采用高效液相色谱分析。薄层色谱通常为非仪器分析方法,操作简便,可作为高效液相色谱流动相、固定相选择的辅助手段。非挥发性试样通过衍生成为挥发性试样,亦可采用气相色谱分析。既可用气相色谱,亦可采用高效液相色谱分析的试样,通常首选气相色谱法,因为前者分析成本相对低些。总体来看,高效液相色谱比气相色谱适用的试样类型、范围或应用领域要广得多。
二 分离操作条件优化
(一)提高理论塔板数
1.适当增加柱长
根据式子,如果板高H已知,可求出获得一定分离度所需柱长。
L=16HR2(/a-1)2(k2+1/k2)2
增加柱长是提高理论塔板数最直接的方法。实际色谱分离条件优化过程中,一般根据试分离条件下的R1,N1或L1,按R1/R2=N1/21/N1/22,在板高一定时,可估算达到更高或所需分离度R2要求的理论塔板数N2或柱长L2。
N2=(R2/R1)2N1
L2=(R2/Rl)2L1
采用增加柱长提高理论塔板数,其操作较为简单。但分离时间随柱长增加而增加;柱系统渗透性随柱长增加而下降,特别是填充柱。欲保持一定流动相流速,需提高柱前压,对色谱仪器耐压性能提出更高要求。因而填充柱柱长变化范围有限;高渗透性开管柱长具有较宽可变范围,增加柱长更具实用价值。如开管柱气相色谱柱长可在10-300m范围变化。
2.提高柱效
柱效通常指单位柱长的理论塔板数N。据根板高方程,H随流动相流速u变化。对高效液相色谱,在分离速度允许下,尽可能降低流动相流速,以改善传质,提高柱效。对气相色谱,为兼顾分离速度,总是选择流动相流速大于最佳流速uopt。
降低固定相填料粒径dp、固定相液膜或键合层厚度df;采用低相对分子质量、低赫度流动相及适当提高柱温以改善传质等均有利于提高柱效。
(二)调节、控制保留因子
常用调控保留因子改进分离。一般k2增大可提高分离度,但分离时间会增长。可方便地将分离度、分离时间改写成k的函数:
R=Qk2/1+K2
和tR2=Q’(1+k2)3/k22
式中Q和Q’分别为方程中的其他部分。说明在Q,Q’保持大致恒定条件下,R-Q,tR2-Q’与k的关系。它清楚表明,k>10以上是不可取的,这时R很小的增大会导致分离时间显著增加。k为2左右分离时间最短,兼顾分离度和分离时间,k最佳值在2-10之间。
通常气相色谱采取改变柱温;气液色谱亦可改变固定液的量,即改变相比等调节保留因子。高效液相色谱在色谱柱或分离模式确定后,主要以改变流动相溶剂组成调控保留因子k。高效液相色谱流动相溶剂组成变化对分离显著影响的典型色谱图。在最小分离时间获得一定分离度的最佳条件。
(三)提高选择性因子
根据分离度方程,R正比于(a-1)/a。若a=1,R=0,两组分不可能分离;a略大于1,两组分才可能分离;a>2-5,分离比较容易实现。a从1.01增大到5,(a-1)/a增加近100倍。相比之下,k从1增大到50,k/(1+k)从0.5变化至接近于1,只增大一倍。显然,a是影响R最敏感的因素。从分离速度方程说明,分离时间与[a/(a-1)]2成正比。a对tR的影响非常显著,例如,a从1.05增加到1.10,分离时间缩短至四分之一。此外,以提高k增加分离度,需以分析时间增长为代价;而提高a增加分离度,可缩短分析时间。因此,提高选择性因子是提高分离度和分离速度最有效的手段。
保持k在1-10的范围内,欲提高a值可依次采取下述技术措施。
1.改变流动相组成
改变二元或多流动相组成,导致各组分间相对保留值变化。如果被分离组分包含有可解离的酸或碱亦可改变流动相pH,以提高分离度和分离速度。各种流动相添加剂,如离子对试剂可提高离子性溶质分离选择性。这些主要适用于以高效液相色谱为代表的各种液相色谱方法。
2.改变柱温
方程中没有温度参数,然而柱温既影响色谱动力学因素,亦影响热力学因素,是优化分离的重要操作条件,特别是对气相色谱。绝大多数选择性因子a与柱温成反比,柱温降低,a升高。适当降低柱温,有利于提高分离度。然而不同色谱方法,柱温对a影响大小不完全等效,气液色谱、反相高效液相色谱、离子交换色谱等影响较显著。
3.改变固定相
这是提高选择性因子的有效方法,特别是气液色谱,尽管操作较费时一些。多数实验室一般都保存几种不同固定相的色谱柱供交换使用。某些试样只有选用适当固定相才可能分离。如对映体类试样主要采用各种手性色谱固定相分离。
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