一  离子对色谱

离子对色谱（ion-pairchromatography）是一种分离分析离子性溶质的色谱方法。在色谱体系中引入一种与试样溶质离子电荷相反的离子对试剂，通常称为对离子或反离子（counterion)，它与溶质离子形成离子对，从而改变溶质在两相中的分配，使离子性溶质的保留行为和分离选择性发生显著变化。常用的离子对试剂有提供阴离子的C4-C8烷基磺酸盐、烷基硫酸盐、羧酸盐、萘磺酸盐、高氯酸盐等；提供阳离子的季铵盐和烃基胺，如四丁基铵盐、十六烷基三甲基铵盐、三乙胺等。将离子对试剂涂渍在液液色谱的硅胶载体上或溶于流动相中，可构成液液离子对分配色谱，由于固定相的流失，这类离子对色谱应用不多。在反相色谱中，离子对试剂加入缓冲液和甲醇、乙腈等极性有机溶剂的流动相构成反相离子对色谱。由于离子交换色谱固定相传质速率慢，柱效低的缺点，对质量大的有机离子分离，反相离子对色谱是更合适的选择，成为当今广泛应用于羧酸、磺酸、胺、季铵盐、氨基酸、多钛、核苷酸及衍生物等有机酸、碱和两性化合物的重要分离分析方法。

基于反相离子对色谱溶质保留行为及影响因素，已提出形成离子对、动态离子交换和离子相互作用等多种保留机理。其中形成离子对是较为典型的过程，主要原理是在水溶液流动相中溶质离子X＋和相反电荷对离子Y-（若X带负电荷，则Y带正电荷）形成离子对［X+Y-]，作为中性的缔合物或络合物由于疏水效应转移到非极性有机键合相：

[X⁺]m+[Y^-]m↔[X⁺Y-]s

反应平衡常数KXY也称为萃取常数（因离子对先前已用于离子对萃取），下标m,s指流动相和固定相。

KXY=[X+Y-]s/[X+]m[Y-]m

X在两相中的分配系数K为两相中浓度比：

K=[X⁺Y-]s/[X⁺]m=KXY[Y-]m

色谱过程中溶质的保留值k为

k=KVs/Vm=KXY[Y-]mVs/Vm

上式说明，溶质的k与KXY和流动相离子对试剂浓度[Y-]成正比。KXY与溶质解离度、对离子的类型及结构、性质有关。因此影响溶质保留和分离选择性的因素，除一般反相色谱条件外，主要还有流动相缓冲液的pH应高于溶质的pK值，以确保溶质解离呈离子态；离子对试剂具有适当烷基链、疏水性，在水溶性流动相有较好溶解度，且可调节一定浓度范围。因此改变离子对试剂的结构和浓度可以控制k值和提高a值。采用具紫外吸收的离子对试剂可测定非紫外吸收试样，称为间接光度离子对色谱。反相离子对色谱的主要缺点是反相键合填料适应pH范围（pH2-8)限制，若采用有机聚合物反相填料能扩大离子对色谱应用pH范围，然而有柱效低的缺点。

二 手性色谱

手性色谱法（chiralchromatography）直接分离手性化合物对映体具有速度快、柱效高、操作简便、适用范围广的优点。气相色谱由于高柱温及可能引起手胜固定相外消旋化的缺点，其应用受一定限制。手性高效液相色谱可分为手性固定相（chiralstationaryphase,CSP)／非手性流动相和非手性固定相／含手性选择剂流动相，即手性流动相两种色谱技术。具实用价值手性流动相添加剂品种较少，这里主要介绍前者。采用手性固定相CSP的高效液相色谱体系的流动相与一般分配色谱相似，根据CSP与流动相相对极性不同可构成正相或反相色谱，其中采用极性水溶性流动相的反相手性色谱应用较多。CSP通常是将手性物质化学键合或涂渍在载体表面上制成。化学键合CSP通过含活性基团（如烃胺基）的有机硅偶联剂将手性物质键合到硅胶等基质表面，是当今主要CSP类型，已有100多种商品化。试样中对映体与键合的手性分子通过氢键、π-π、偶极、疏水、静电、包络和立体镶嵌等相互作用，形成瞬间非对映异构体络合或复合物的结合能力差异，实现对映体拆分。下面介绍常用的CSP类型及相应色谱体系。

1．给体一受体手性固定相

这是Pirkle研究组最先开发的一类CSP，由含末端羧基或异氰酸酯芳香烃手性配体与氨基键合硅胶缩合，分别形成具手性取代芳香酰胺或脲型结构CSP，亦称为Pirkle手性固定相。

R*-COOH十H2N(CH2）n-SiO2→R*-CONH(CH2)n-SiO2

R*-NCO+H2N(CH2）n-SiO2→R*-NHCONH(CH2)n-SiO2

它们具有确定的化学结构，其共同结构特征是在手性中心附近含有取代芳基的π电子给体或π电子受体的π-π作用基团；形成氢键和偶极作用的极性基团；立体位阻的大体积非极性基团，这些是三点作用手性识别模式的结构基础。例如广泛使用的3,5，一二硝基苯甲酰苯基丙氨酸键合CSP为π电子受体，芳香化合物是良好的π电子给体，因此能有效分离芳香对映体。这种CSP立体选择作用点示意图。PirkleCSP手性分子具有独立手性识别能力，大多可用三点作用规律解释，固定相分子设计、溶质对映体洗脱顺序可以预测，并可提供溶质绝对构型的有关信息。它是目前使用量较大、适用面广、柱容量高的CSP。一般用于正相色谱体系，不仅用于对映体分析，也可用于制备分离。其主要缺点是被分离溶质大部分需衍生化引入芳基等手性识别所需基团；多使用非极性溶剂流动相可能限制某些溶质分离。

2．多糖类手性固定相

主要是纤维素及其衍生物CSP，以引进芳环的取代苯甲酸酷衍生化纤维素居多，如纤维素三（3,5一二甲苯基氨基甲酸酯）、纤维素三（(4一甲基苯甲酸酯）、纤维素三乙酸酯等。大多数应用是涂渍在微粒硅胶上，亦有通过羟基和有机硅偶联剂缩合，化学键合至硅胶上。研究表明，纤维素类CSP手性识别机理复杂，至今仍未完全阐明。一般认为取决于聚合物螺旋型空穴“立体配合”(stericfit）包结作用，氢键、偶极作用及CSP超分子结构对立体识别均有一定影响。纤维素CSP用水或非水溶剂流动相，分别构成反相和正相色谱。流动相影响对映体分离选择性，正己烷等非极性溶剂通常要比甲醇／水混合液显示较高分离选择性。这类CSP具有应用范围广、试样容量高、价格低的优点；缺点是柱效低，有些溶质呈不可逆吸收，涂溃柱易流失，所用溶剂有一定限制。

3．环糊精手性键合固定相

亦称为空穴型固定相。环糊精简称CD，具手性空穴结构，有a,β,γ等类型，分别由6(a),7(β），8（γ）个葡萄糖苷形成环状空穴结构，其空穴直径依次增加。空穴开口处由极性羟基包围，而空穴本身呈疏水性，可与各种有机分子形成包结络合作用，分子整体上具有光学活性和立体识别能力。分子中的羟基为其衍生化、改性、键合提供了结构基础。通过氨或酰胺键可将CD键合到硅胶表面。不含氮、水解稳定的CD-CSP是以含环氧基、卤代烃或乙烯基键合硅胶为中间体，与CD反应合成。

CD-CSP可实施正相和反相两种色谱体系。在反相色谱中，其保留和立体识别机理是溶质在CD空穴中的包容络合及与空穴边缘上的经基氢键作用，这两种作用必须同时提供手性识别所需要的三个能量上不同的作用点。天然CD键合相正相色谱体系，有机溶剂占据CD空穴，未能观察到对映体选择性。因此手性分离主要采用反相体系，正相体系用于异构体及胡萝卜素分离。CD衍生化提高了手性识别能力，不仅反相体系，正相体系亦可实现手性分离。如β-CD氨基甲酸萘乙酯CSP，是具有包容络合、π-π,氢键作用和大体积空间障碍基团的多模式手性固定相。CD-CSP除用于分离手性芳香族有机酸、醇、酯、氨基酸、糖类及衍生物外，其应用最多的是分离各种手性药物对映体。

4．蛋白质手性固定相

主要有牛血清蛋白（BSA)、人血清蛋白（HBA),a一酸性糖蛋白（AGP)、蛋白酶，如a一胰凝乳蛋白酶（ACHT）等。一般通过含氨基、二醇基等键合硅胶中间体将蛋白质键合至硅胶上。这类CSP只能用于反相色谱体系。蛋白质CSP的手性选择性机理十分复杂，已观察到疏水效应、氢键形成、电荷性质、立体效应等对立体选择性影响。由于这类CSP的超分子构型相当复杂，对其手性分离机理知之甚少，因而分离条件优化一般相当困难，不仅流动相对蛋白质CSP次级结构立体活性点的活性影响非常敏感，而且不同的键合技术可能形成蛋白质络合点不同的微环境，以致完全改变其手性选择性。这类CSP价格昂贵，中等柱效，使用寿命欠佳等在一定程度上限制其应用。尽管存在这些缺点，但按CSP的通用性来讲，大致顺序为：蛋白质＞多糖类＞环糊精>Perkle型，该顺序将随CSP制备技术的发展而变化。蛋白质CSP的特殊对映体选择性，其适用范围最广，多种外消旋体，包括许多药物，至今只能在蛋白质CSP上分离。在蛋白质CSP上直接分离未衍生化蔡普生手性药物对映体。

其他还有大环抗生素、配体交换、手性冠醚、电荷转移、印迹聚合物等应用还不多的CSP。

五 亲和色谱

亲和色谱（affinitychromatography）以生物活性配体（如酶、抗体、激素等）通过间隔臂键合到多孔微粒固体基质为固定相，不同pH的缓冲溶液为流动相，依据生物分子（氨基酸、钛、蛋白质、核酸等）与固定相配体间的特异、可逆的相互亲和作用力差异，即形成可解离的配位复合物，亦称为锁一键结构复合物或络合物（lock-and-keystructuralcomplex)，实现生物活性分子分离和纯化。这种亲和作用涉及分子间疏水、范德华力、静电力、络合作用及空间位阻效应等多种因素。亲和色谱过程中，生物活性分子与配体作用被吸留（吸收、吸着）是基于生物活性，而不是物理化学性质，被吸留的活性分子只有改变流动相组成时才被洗脱。当色谱体系中固定相上配体的起始浓度远大于生物活性分子浓度和复合物浓度时，溶质保留值k正比于配体的起始浓度，反比于复合物解离常数。特别适用于低浓度生物大分子，如蛋白质的分离纯化，可稳定蛋白质的结构和活性，且收率高。

亲和色谱固定相由基质、间隔臂和配体三部分组成。

(1)基质材料有天然和合成聚合物等有机基质，如葡聚糖、聚丙烯酰胺及衍生物、交联聚苯乙烯等；无机基质是硅胶、氧化锆、氧化钛。基质均需通过功能化反应活化，在表面引入活性基团，如羟基、氨基、环氧基等。

(2）间隔臂通常为不同链长的双功能基化合物，如二醇、二胺、二酸、氨基酸等。

(3)亲和色谱固定相配体，其结构类型多种多样，主要是：①染料；②具包结络合作用的大环化合物，如环糊精、杯芳烃等；③生物特效配体，如氨基酸、多钛、蛋白质、抗体、抗原、核苷、核苷酸、辅酶、核糖核酸、脱氧核糖核酸及微生物等生物小分子或大分子；④还可能是与生物活性分子发生作用的药物，如阿普洛尔、四氢大麻酚等。其中生物特效配体固定相是亲和色谱最重要固定相材料。固定相配体浓度越高，溶质保留值越高，试样容量越大。

胞嘧啶核苷酸（CMP)配体，通过丁二酸间隔臂，键合到氨丙基活化的硅胶亲和色谱固定相结构。这种固定相已用于细胞色素C、核糖核酸酶、溶菌酶、纤维素酶、牛血清蛋白等纯度分析。亲和色谱固定相粒径从3μm到几百μm,10μm以下用于分析分离；大粒径填料用于实验室制备或工业规模纯化分离。

亲和色谱分离、纯化对象皆为上述作为生物特效配体及寡糖、多糖等生物分子，多为具生物活性的极性化合物，要求洗脱条件比较温和，以保持生物活性。其流动相为接近中性的稀缓冲液，例如，磷酸盐、硼酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、三羟甲基甲烷与盐酸、顺丁烯二酸等构成的具不同pH缓冲液体系。当生物分子与固定相配体存在强亲和作用时，需在流动相中加入一种游离配位基，以取代固定相上配体并与被分离生物分子结合，从固定相上洗脱出来。改变流动相类型、pH、离子强度或改性剂可调节溶质保留值和提高分离选择性。胸腺嘧啶脱氧核苷酸十八聚体（(dT)18键合在硅胶亲和色谱固定相上，3h程序升温8℃至44℃，分离寡聚腺苷酸十二（A12）至十八（A18）聚体七个组分。