一 毛细管区带电泳

（一）基本操作条件

毛细管区带电泳（capillaryzoneelectrophoresis,CZE）也称为毛细管自由溶液区带电泳，是毛细管电泳最基本，也是应用最广的一种操作模式。其分离原理是基于试样组分质荷比的差异。溶质流出顺序依次为正电粒子、中性粒子和负电粒子，质荷比越大的正电粒子流出越快。在CZE中，需要控制的操作变量主要是电压、缓冲溶液浓度、pH和添加剂等。

一般地讲，在柱长确定时，随操作电压升高，电渗流和电泳流速率的绝对值都增加，由于电渗流速率一般远大于电泳流速率，因此表现为粒子的总迁移速率加快。在升高电压的同时，将使柱内的焦耳热增加，缓冲溶液的黏度减小，而黏度和温度的关系是指数型的，因此使操作电压和迁移时间的关系不呈线性，表现为电压高时速率增加更快一些。柱效在一定范围内随操作电压升高而增加，当焦耳热的影响较大时，柱效随电压升高反而下降。

缓冲溶液类型、浓度（离子强度）和pH不仅影响电渗流，也影响试样溶质的电泳行为，决定着CZE柱效、选择性和分离度的好坏以及分析时间的长短，对CZE分离条件优化具有重要意义。缓冲溶液的选择通常需遵循下述要求：

(1)在所选择的pH范围内有合适的缓冲容量；

(2)本底检测响应低；

(3)自身的淌度低，即离子大而带电小。

硼酸盐、三羟甲基氨基甲烷（Tris）等缓冲溶液体系由于离子较大，能够在较高浓度下使用也不会产生大电流，同时缓冲能力较强，因而在毛细管电泳中经常被采用。在配制毛细管电泳用的缓冲溶液时，必须使用高纯蒸馏水和试剂，使用前要经过0.45μm的滤器过滤，以免堵塞毛细管。

缓冲溶液pH决定弱电离试样的有效淌度，同时还控制着电渗流的大小和方向，一般通过实验优化来选择最佳pH。随着缓冲溶液浓度的增加，缓冲容量增加，但电渗流降低，溶质在毛细管内的迁移速率下降，因此迁移时间延长。

在CZE分离中，除了背景电解质外，常常还在缓冲溶液中加入某些添加剂。通过它与管壁或与试样溶质之间的相互作用，改变管壁或溶液物理化学特性，进一步优化分离条件，提高分离选择性和分离度。添加剂的种类主要有以下几类：

1．中性盐

缓冲溶液中加入高浓度的中性盐后，大量的阳离子将参与争夺毛细管壁的负电荷位置，从而降低管壁对蛋白质的吸附。阳离子愈大，覆盖毛细管壁愈有效。

2．表面活性剂

如十二烷基硫酸钠、十二烷基季铵盐等；表面活性剂具有吸附、增溶、形成胶束等功能。低浓度的阳离子表面活性剂，能在石英毛细管表面形成单层或双层吸附层，改变EOF大小甚至使EOF反向，在缓冲溶液中加入溴化十六烷基三甲铵(CTAB),CTAB分子首先通过静电作用吸附到毛细管内壁形成第一层，然后又通过疏水相互作用吸附第二层CTAB分子，从而使毛细管内壁所带电荷由原来的负电荷变为正电荷，使EOF方向发生反转。必须说明的是加入缓冲溶液的表面活性剂浓度必须低于其临界胶束浓度（CMC浓度），否则会形成胶束，使毛细管的分离机理发生变化，即从CEZ分离模式变为胶束电动毛细管色谱（MEKC）分离模式。

3．手性添加剂

如手性冠醚、环糊精。一般的CZE并不具备手性选择性，难以实现手性拆分的目的，因此往往需要在运行缓冲液中加入手性添加剂来实现对光学异构体的手性拆分。

4．非电解质高分子添加剂

如纤维素、聚乙烯醇、多糖等。高分子类添加剂可以形成分子团或特殊的局部结构，从而影响试样的迁移过程，改善分离。高分子添加剂也可以强烈吸附在毛细管壁上，影响电渗以及分离过程。

CE缓冲溶液一般用水配制，对于许多水难溶的试样由于溶解度的原因分离效果不好。如果在缓冲溶液中加入少量的有机溶剂，常常能有效改善分离度。常用的有机溶剂主要有醇类、乙腈、丙酮、四氢呋喃、二甲亚砜，其中最常用的是甲醇、乙腈。在极端情况下，可完全使用有机溶剂，或以有机溶剂为主体，这就是非水毛细管电泳技术。

（二）应用

毛细管区带电泳特别适合分离带电化合物，包括无机阴离子、无机阳离子、有机酸、胺类化合物、氨基酸、蛋白质等，不能分离中性化合物。毛细管电泳出现之前，分析小的阴离子常用离子交换色谱法，分析阳离子采用原子光谱法。由于毛细管电泳试样用量少、成本低、速度快、分离效果好，成为分析离子性化合物的新方法。

二 胶束电动毛细管色谱

胶束电动毛细管色谱(micellarelectrokineticchromatography,MEKC）是以胶束为准固定相的一种电动色谱，是电泳技术和色谱技术的巧妙结合。MEKC是在电泳缓冲溶液中加入表面活性剂，当溶液中表面活性剂浓度超过临界胶束浓度时，表面活性剂分子之间的疏水基团聚集在一起形成胶束，成为分离体系的准固定相，溶质基于在水相和胶束相之间的分配系数不同而得到分离。与毛细管区带电泳相比，MEKC的突出优点是除能分离离子化合物外，还能分离不带电荷的中性化合物。

在MEKC系统中，实际上存在着类似于色谱的两相，一是流动的水溶液相，二是起到固定相作用的胶束相，溶质在这两相之间分配，由于溶质在胶束中不同的保留能力而产生不同的保留值。与毛细管区带电泳一样，由于管壁带负电，水溶液相因电渗流作用向阴极移动。胶束相按照其所带电荷极性不同，具有与周围介质不同的电泳淌度。对于常用的十二烷基硫酸钠（SDS)胶束来说，由于其外壳带负电荷，本应以较大的淌度朝阳极迁移，但在一般情况下，电渗流的速率大于胶束的迁移速率，这就迫使胶束最终以较低的速率向阴极移动。由此可见，胶束电动色谱有别于普通色谱的一个重要特性是它的“固定相”是移动的，这种移动的“固定相”又被称为“准固定相”。典型的准固定相为阴离子或阳离子表面活性剂，也可以用带电的有包容作用的络合物，如环糊精类物质。对于中性粒子，溶质的迁移速率决定于它在两相间的分配系数。具有不同疏水性的粒子与胶束相互作用不同，疏水性强的作用力大，其留在胶束相中的时间就长。因胶束相的绝对速率很小，故组分的保留时间就长，反之组分较多地停留在缓冲液中按电渗的速率移动，因此，保留时间较短。

在MEKC中，迁移时间窗口是指完全溶于水流动相的中性溶质的迁移时间t0）与完全溶于胶束中的溶质迁移时间（tmc）之间的时间间隔（tmc--t0)。t0由电渗流速率决定，理想的情况等于电渗流速率，tmc等于胶束通过分离柱所需时间。带负电荷的离子胶束（如SDS胶束）受与电渗流反向的电泳力作用，迁移较慢，在最后流出。胶束中有适当溶解度的中性试样溶质，迁移时间落在迁移时间窗口内,t0<tr<tmc。迁移时间窗口也常用迁移时间比（t0/tmc）表示，t0/tmc是MEKC中一个重要的参数，减少t0/tmc比值，将使迁移时间窗口增宽，峰容量增加。

三 毛细管凝胶电泳

毛细管凝胶电泳（capillarygelelectrophoresis,CGE）是在毛细管中充填多孔凝胶作为支持介质进行电泳。凝胶在结构上类似于分子筛，当被分离分子的大小与凝胶孔径相当时，其淌度与尺寸大小有关，小分子受到的阻碍较小，从毛细管中流出较快，大分子受到的阻碍较大，从毛细管中流出较慢，因此分离主要是基于组分分子的尺寸，即筛分机理。CGE常用于蛋白质，寡聚核苷酸、RNA及DNA片段的分离和测定。以DNA为例，其质荷比往往与分子大小无关，因为DNA链每增加一个核苷酸，就增加一个相同的质量和电荷单位，对它在自由溶液的淌度没有影响，因此用CZE方法不可能实现分离，而用CGE方法则可根据DNA分子的大小进行有效的分离。

凝胶是毛细管电泳的理想介质，它豁度大，抗对流，能减少溶质的扩散，因此能限制谱带的展宽，所得的峰型尖锐，柱效高，有可能使组分在短柱上实现极好的分离。

常用的凝胶有聚丙烯酞胺和琼脂糖，应用最多的是前者。聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺（Acrylamide,Acr）和N,N’一亚甲基双丙烯酰胺（N,N'-methylene-bis-acrylamide,Bis）交联聚合而成，前者被称为聚合单体，后者被称为共聚单体或交联剂。交联的聚丙烯酰胺凝胶具有三维网状多孔结构，透明而不溶于水，化学性质稳定。因为没有带电基团，凝胶呈电中性，无吸附作用，机械强度高，有韧性。在CE中具有抗对流、减小溶质扩散，阻挡毛细管壁对溶质的吸附和消除电渗流等作用。此外，它的多孔结构还有分子筛效应。是一种性能优良的筛分介质。聚丙烯酰胺凝胶的孔隙大小为3-30nm，由单体和交联剂的浓度决定，单体浓度愈高，孔径愈小。凝胶浓度和交联度分别用T和C表示：

T=ma+mb/V×100％

C=mb/ma+mb×100％

式中ma为Acr的质量（g),mb为Bis的质量（g),V为缓冲溶液体积（mL)。me/b接近30时可以制成既有弹性又完全透明的凝胶。可以通过控制T,C大小，改变凝胶孔径大小，对被分离组分起到分子筛作用。增加交联度或降低丙烯酞胺的量都能加大孔径，大孔径适于DNA序列反应产物的测定。反之，减少交联剂的量（即降低交联度）或增加丙烯酰胺的量均能使孔径变小，以适于蛋白质和寡核苷酸的分离。
聚丙烯酰胺凝胶毛细管的制备有一定技术难度，主要问题在于：

(1)单体溶液在成胶过程中体积收缩，引起毛细管内凝胶断裂或留下空泡。毛细管越细，收缩越困难，空泡就会越多。

(2)细管中的凝胶，会因为电渗、电场以及缓冲液的作用而滑出或膨胀溢出毛细管。

(3）凝胶中出现的极小的气泡，在高压下产生局部放电，造成凝胶的突然毁坏。

(4）凝胶的紫外背景吸收强，造成检测困难。

为了解决上述问题，得到能反复使用的凝胶管，主要技术措施是：

(1)为防止凝胶的滑动，可将凝胶键合固定在毛细管壁上或两头加塞堵在管内；

(2)为防止凝胶出现空泡，可采用高压聚合、逐步聚合等方法；

(3）为解决检测问题，可设法降低凝胶的检测背景。

琼脂糖凝胶是D一半乳糖和3,6一脱水一L一半乳糖相间结合的链状多糖。琼脂糖是一种天然的线状高分子，这类载体能使被筛分物质保持活性，能迅速活化并接上各功能基因，结构疏松，孔径大，透光性好，常用来分离病毒、DNA和大分子蛋白质。琼脂糖容易成胶，相对而言，琼脂糖凝胶毛细管比较容易制备。它的渗透极限很高，但是较易堵塞。

由于凝胶毛细管柱制备困难，寿命短，进样端易堵，有人提出用低薪度的线性聚合物溶液代替高黏度交联的聚丙烯酰胺，即无胶筛分技术。这种线性聚合物溶液仍有按分子大小分离组分的分子筛作用，只是不在柱内作交联反应，因此可避免气泡的形成。它比凝胶柱便宜、简单，其功能可以通过改变线性聚合物的种类、浓度等予以调节。这种柱子具有寿命长，制备容易，能方便地注入毛细管中重复使用等优点，但它的分离能力较凝胶柱略差。常用的无胶筛分剂包括未交联的聚丙烯酰胺，甲基纤维素及其衍生物，聚乙二醇和葡聚糖等，前两种通常用于核酸及其片段的分离，后两种更多地用于蛋白质。

四 毛细管等电聚焦

在电场作用下带电粒子将在电介质中作定向迁移，这种迁移和粒子的带电状况有关。蛋白质是典型的两性电解质，所带电荷与溶液pH有关，其表观电荷数为零时溶液的pH称为蛋白质的等电点（PI)。不同的蛋白质等电点不同，溶液pH小于等电点时，蛋白质带正电荷，在电场作用下向负极迁移；溶液pH大于等电点时，蛋白质带负电荷，在电场作用下向正极迁移；当迁移至pH和等电点一致的溶液中而溶液自身又不受电渗的推动，则迁移就停止进行。如果溶液存在一个pH的位置梯度，那么有可能使具有不同等电点的分子分别聚集在不同的位置上，不作迁移而彼此分离，这就是所谓的等电聚焦过程。毛细管等电聚焦（capillaryisoelectricocusingelectrophoresis,CIEF）过程是在毛细管内实现的，毛细管等电聚焦结合了常规凝胶等电聚焦的高分离能力和现代毛细管电泳的特点。由于可以施加高电场，使分离时间缩短，而小内径可较平板凝胶更为有效地散热，同时能够进行实时检测，具有极高的分辨率，可以分离等电点差异小于0.01pH的两种蛋白质。

毛细管等电聚焦的载体为两性电介质的混合物，它被注入毛细管中，施加电压后，带正电的电介质流向阴极，带负电的流向阳极，使阴极端的pH升高，阳极端的pH降低。两性电介质载体中各组分分别停留在与自身等电点对应的位置上，并在两者之间形成一个梯度。

毛细管等电聚焦有三个基本步骤，即进样、聚焦和迁移。

第一步，进样。预先使脱盐试样以1%-2％的含量与两性电介质混合，对于复杂混合物或未知物采用两性电介质的范围宜宽一些，反之则用范围窄一些，采用窄范围的两性电介质有利于得到高的分辨率。阳极槽装满稀释的磷酸，阴极槽装满稀释的氢氧化钠，用压力将试样和两性电介质的混合物压入毛细管。由于试样和两性电介质一起引入毛细管柱，因此等电聚焦的进样量可以远远大于毛细管电泳的其他操作模式。

第二步，聚焦。采用500-700V/cm的电场强度施加高压3-5min，直到电流降到很低的值。在这一过程中，在毛细管的整个长度范围内两性电介质建立了一个pH梯度，然后蛋白质在毛细管中向各自的等电点聚焦，并形成一个非常明显的带。因此，等电聚焦实际上是一个试样的浓缩过程，这一过程可以用于浓缩试样组分。

第三步，迁移。毛细管等电聚焦的检测器通常位于毛细管的一端，因此必须使已聚焦的区带移动，像队列一样依次通过检测器接受检测。目前大体有三种办法，一是通过加盐使之作电泳迁移，二是用流体动力学方法迁移，三是电渗迁移。如采用第一种方法，典型的做法是将氯化钠加入阴极槽中，再施加高压（(6-8kV)，这时氯离子进入毛细管，在近阴极端引起pH降低，使聚焦的蛋白质依次通过检测器。所谓的流体动力学方法是用泵或真空使毛细管内的物质通过检测器。电渗迁移的方法又称为一步聚焦法，蛋白质是在聚焦的同时通过检测器的。

血红蛋白变体的分析是毛细管等电聚焦应用最多的一个方面，这在临床上具有重要意义，如筛选与贫血有关的异常血红蛋白。除此之外，毛细管等电聚焦还可用于单克隆抗体分析、酶突变型的鉴定、重组蛋白的纯度分析、人血浆蛋白分析等。

五 毛细管等速电泳．

毛细管等速电泳（capillaryisotachophoresis,CITP）是一种不连续介质电泳技术，它采用两种不同的缓冲溶液系统，一种是前导电介质，充满整个毛细管柱，另一种称尾随电介质，置于一端的电泳槽中，前者的淌度高于任何试样组分，后者则低于任何试样组分，被分离的组分按其淌度不同夹在中间，以同一个速率移动，实现分离。如分离阴离子，试样离子A-,B-和C-迁移率顺序为A->B->C-，施加电场后，由于各种离子迁移率不同，向正极迁移的速率不同，使电解质溶液形成由负极到正极增加的离子浓度，而电位梯度与电导率成反比，离子浓度越大，电导率越大，因此电位梯度由负极到正极减小。由于离子的迁移速率与电场强度成正比，迁移速率大的离子A-在较小电场强度的作用下迁移速率逐渐减慢，C-则逐渐加快。随着电泳的进行，A-,B-,C-三种离子必将以和前导电介质相同的速率向前移动。此时若有任何两个区带脱节，其间阻抗趋于无穷大，在恒流源的作用下电场强度迅速增加，迫使后一区带迅速赶上，保持恒定。

所有谱带以同一速率移动是等速电泳的最大特点。除此之外，等速电泳还有两个特点。一是区带锐化，在平衡状态下，如果有离子扩散进入相邻区带，由于它的速率和这一区带上主体组分离子的速率不同，迫使它立刻返回自己的区带，形成界面清晰的谱带。二是区带浓缩，即组分区带的浓度由前导电介质决定，一旦前导电介质浓度确定，各区带内离子的浓度即为定值。因此对于浓度较小的组分有浓缩效应，这种浓缩效应已被用作其他毛细管电泳操作模式的预浓缩手段。