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LC-MS联用中的技术问题

发布时间:2015-08-13 00:00 作者:中国标准物质网 阅读量:2394

现在,LC的应用范围已经远远超过气相色谱,这里指的主要是HPLC。液相色谱一质谱(LC-MS)联用技术的研究始于20世纪70年代,然而由于技术难度大,其发展一直非常缓慢。直到80年代中期才出现被广泛接受的LC-MS联用商品仪。与GC-MS相比,LC-MS连接更为复杂,对接口的要求更为苛刻。除此之外,由于LC分析的化合物大多是极性强、挥发性差、易分解或不稳定的化合物,对质谱的离子源系统有很高的要求。经典的电子轰击法(EI)和化学电离法(CI)并不适用于这些化合物。因此LC-MS的发展除受接口技术的制约外,与质谱仪离子化系统的发展亦息息相关。LC-MS是在研究出热喷雾电离(TSI)、大气压化学电离(APCI)后才获得迅速的发展。当前在LC-MS中,许多接口技术已基本融入质谱的离子源系统中。与GC-MS类似,仪器由LC、接口、MS和计算机控制系统等部分组成。

一 接口的要求和发展

接口装置是LC-MS联用的技术关键之一,其主要作用是去除溶剂并使试样离子化。早期曾经使用过的接口装置有传送带接口、热喷雾接口、粒子束接口等十余种,这些接口装置都存在一定的缺点,因而没有得到推广。20世纪80年代,大气压电离源用作LC和MS联用的接口和电离装置之后,使得LC-MS联用技术提高了一大步。目前,几乎所有的LC-MS联用仪都使用大气压电离源作为接口装置和离子源。大气压电离源(atmospherepressureionization,API)包括电喷雾电离源(electrosprayionization,ESI)和大气压化学电离源(atmos-phericpressurechemicalionization,APCI)两种,二者之中电喷雾电离源应用最为广泛。

二 直接液体导入接口

直接液体导入接口(DLI)实际上是将LC的柱后流出物经分流后,很少一部分在质谱仪真空泵抽引产生的负压驱动下,通过金属毛细管或多孔薄膜喷射形成细小的液滴,进入接口,在加热条件下脱去溶剂,然后试样再进入离子源实现离子化。DLI是液质联用中最简单的接口,造价低廉,但其无法在大流量下工作,难以和LC相匹配,同时喷射过程中喷口容易堵塞,没有形成商品化仪器。

三 移动带接

移动带接口(movingbelt,MB)是最早研究的LC-MS接口之一。其接口原理是在LC柱后增加一个移动速度可调整的传送带,传送带置于红外线加热场中。试样经LC分离后,色谱柱流出物直接滴落在传送带上,通过红外线加热除去大部分溶剂,进入密闭真空室,在真空中溶剂被进一步脱除,同时待测试样挥发并导入离子源,电离后进行质谱分析。移动带将残留未挥发试样带出离子源,经加热等方法去除残留试样,净化后的传送带循环使用。在传送带接口技术中,试样的离子化往往是通过El源或CI源进行,也可用FAB离子化技术。

传送带技术的最大缺点在于离子化效率低,尤其是那些沸点较高、挥发性很差试样很难实现离子化,因此传送带技术难于满足日益提高的质谱分析要求。除此而外,传送带净化清理的可靠性差,重复使用时容易产生记忆效应而干扰试样分析。

四 热喷雾接口

热喷雾接口((thermospray,TS)出现于20世纪80年代中期,是第一个被广泛使用的LC—MS商用接口,它将接口和电离技术有机地融为一体。热喷雾接口的核心部件是能够加热的不锈钢毛细管。当LC的流出物以1-2mL/min的流速进入TS中心的不锈钢毛细管(约0.1mm内径、1.6mm外径),在毛细管出口前受到剧烈加热,溶剂快速蒸发,体积膨胀,以超声音速喷出毛细管,形成由微小液滴、粒子和蒸气组成的雾状混合体。当混合体向下游移动时,部分在热喷射过程中已带电荷的小液滴溶剂继续蒸发,表面积迅速缩小,当电荷与液滴表面积之比达到一个临界值时,溶质以离子或离子聚合体的形式从液滴蒸发出来,进入气态,实现质谱分析所需的试样电离,这就是“离子蒸发理论”。

在采用TS接口的LC-MS中,LC流动相中通常会添加合适含量的挥发性电解质(<0.1mol/L),最常用的是醋酸按,由它在喷雾过程中产生大量的气态NH4+,H3O+,CH3COO-等正负离子,与待测试样形成离子加合物从而使其离子化。许多极性化合物在适当的溶剂体系中(如含水量较高的溶剂体系),通过热喷雾过程,可自然产生足够量的气态离子供质谱检测,在此情况下,无需额外的电离手段如电子轰击,此时常被称为“灯丝关闭”(filament-off)。当一些试样如弱极性试样或强极性试样在大量有机溶剂体系,无法产生足够量的离子供质谱检测时,此时需要借助其他手段来辅助电离,如将电子发射灯丝开启,利用电子束轰击雾状混合体,让大量的溶剂分子电离,形成反应试剂,对待测试样进行化学电离,此时这种过程常称为“灯丝开启”(filament-on)。

TS接口适合于LC流速在0.5.2mL/min,以1mL/min为最佳,当LC流速过高或过低时,可采用柱后分流或补偿的方式进行调整。_流动相中水含量较高,通常使用效果较好。值得注意的是,在TS接口中,严禁非挥发性电解质如磷酸盐、离子对试剂等的使用,以免因溶剂蒸发沉淀而堵塞喷雾毛细管。

粒子束接口、

粒子束接口(particlebeam,PB)又称为动量分离器,接口是利用流体力学原理,将溶质转变成中性粒子,利用动量差与溶剂分开后,送入质谱的电离系统。从LC柱后流出物到进入质谱电离室之间经历了三个主要过程:形成气溶胶、脱溶剂和动量分离。LC的流出物经过毛细管到达喷雾口,在毛细管外套管的惰性气体推动下,喷射成雾状小液滴即气溶胶进入具有一定温度的脱溶剂室,气溶胶骤然扩散,挥发度高的溶剂蒸发成气体,而挥发度低的溶质形成亚微米级的粒子或粒子集合体,部分未能蒸发的溶剂与溶质粒子一起进入动量分离器,动量分离器的结构与GC-MS中喷射式分子分离器结构类似,原理相同,溶剂和溶质粒子由于动量不同,获得分离,溶剂被真空泵排空,溶质以气态粒子形式进入电离室实现离子化。

粒子束接口中为了便于溶剂与溶质充分分离,通常要求LC流动相以挥发性的有机溶剂为主,而尽量避免使用含水相,如因LC分离要求,通常也需将含水量控制在50%以内,如果更高的话,可考虑在柱后采用有机溶剂补偿的方式。PB接口的LC-MS适合分离非极性和中等极性的化合物,PB仅起试样输送作用,电离方法依然采用传统的EI或CI源,当选用EI源时可与传统的El质谱库相匹配,便于检索。

六 大气压电离接口

在传统的质谱电离技术中,例如EI,CI,FAB和场电离源等,待测试样的电离均是在质谱的高真空条件下实现。因此,在连接LC和MS时,为避免大量溶剂进入高真空的离子源系统,必须预先脱溶剂,这是LC-MS联用研究早期的主导思想。溶剂和待测试样的分离主要靠两者间挥发度的不同或动量的不同或同时利用两种差异。然而由于溶剂的量远远超过待测试样的量,仅仅依靠这种差异,难于获得溶剂和待测试样的良好分离。同时在LC分离分析时,色谱流动相条件千变万化,使得接口设计很难具有普适性。

大气压电离(atmosphericpressureionization,API)接口的设计跳出传统思维:利用待测试样与溶剂电离能力的不同,将分析物首先在大气压或略低于大气压条件下电离,尔后利用电场导引,将带电试样“萃取”进入质谱高真空系统,与传统的方法相比,大气压电离接口模式利用待测试样和溶剂间带电能力的差异,更利于将二者分开。同时,大气压电离接口更容易和LC相匹配。目前常用的大气压电离接口有电喷雾电离(electrosprayionization,ESI)和大气压化学电离(APCD。

1.电喷雾电离(electrosprayionization,ESI)

电喷雾电离是近年来出现的一种新的电离方式。它既作为液相色谱和质谱仪之间的接口装置,同时又是电离装置,它的主要部件是一个多层套管组成的电喷雾喷嘴。试样溶液从中心0.1mm内径的不锈钢毛细管中以0.5-5μL/min的速度喷出。针尖加有3-8kV电压,形成电场强度高达106V·m-1,毛细针尖周围可形成圆柱形的电极。外层是喷射气,喷射气常采用大流量的氮气,其作用是使喷出的液体容易分散成雾状液滴。雾状液滴在喷射出来时由于针尖电极的作用而带上电荷。另外,喷嘴的斜前方还有一个补助气喷嘴,补助气的作用是使液滴的溶剂快速蒸发。液滴不断挥发而缩小,导致表面电荷密度不断增大。当电荷之间的排斥力足以克服液滴的表面张力时,液滴发生裂分。溶剂的挥发和液滴的裂分如此反复进行,最后得到单电荷或多电荷的离子。离子产生后,借助于喷嘴与锥孔之间的电压,穿过取样孔进入质量分析器。

不同型号仪器ESI设计结构大同小异,但电喷雾电离均包括三个基本过程,即电喷雾、离子的形成、离子的输送。加到喷嘴不锈钢毛细管上的电压可以为正,也可以为负。通过调节电压极性,可以控制试样的电离行为,获得正或负离子。

电喷雾电离源是一种软电离方式,即便是相对分子质量大,稳定性差的化合物,也不会在电离过程中发生分解,适合于分析极性强的大分子化合物,如蛋白质、肽、糖等。另外,电喷雾电离源的最大特点是容易形成多电荷离子,有利于对高分子量试样进行测定。例如,一个相对分子质量为10000的分子若带有10个电荷,则其质荷比只有1000,进入了一般质谱仪可以分析的质量范围之内。电喷雾电离源的另一个显著优点在于很容易实现与高效液相色谱、毛细管电泳等分离技术联用,拓展其应用范围。

2.大气压化学电离源(atmosphericpressurechemicalionization,APCI)

大气压化学电离源(atmosphericpressurechemicalioni-zation,APCI)的结构与电喷雾电离源大致相同,不同之处在于大气压化学电离源中喷嘴下方放置了一个针状放电电极,通过放电电极的高压放电,使空气中的中性分子电离,产生H3O+,N2+,O2+和O+等离子,同时溶剂分子也会被电离,这些离子与试样分子发生离子一分子反应,使试样分子离子化,这些反应过程包括由质子转移和电荷交换产生正离子,质子脱离和电子捕获产生负离子等。

大气压化学电离源主要用来分析中等极性或非极性的化合物。有些试样由于结构和极性方面的原因,用电喷雾电离方式无法产生足够强的离子信号时,可以采用APCI方式增加离子产率。APCI主要产生的是单电荷离子,所以分析的化合物相对分子质量一般小于1000。用这种电离源得到的质谱很少有碎片离子,主要是准分子离子。

APCI源也可用于液相色谱一质谱联用仪、毛细管电泳一质谱联用等。

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