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微流控分析系统的检测器

发布时间:2015-08-14 00:00 作者:中国标准物质网 阅读量:853

试样溶液在微流控芯片通道网络中经过有序的流动,完成取样、稀释(浓缩)、反应、分离等步骤后,最后将由检测器测得试样中有关组分的浓度或结构的信息。检测器的性能将影响整个微流控芯片分析系统的灵敏度、检出限、精密度以及适用范围等分析性能,同时在很大程度上决定了微流控分析系统的总体积。虽然常规流动分析中所用到检测器原则上都可以用于微流控分析,但微流控分析本身的特殊性对检测器提出了一些特殊的要求,例如,(1)高的灵敏度和信噪比。在微流控芯片分析中,由于进样体积往往在纳升至皮升水平,可供检测的物质量很少,加上检测的区域一般非常小,所以要求检测器具有很高的灵敏度和信噪比。例如,在常规流动注射分析中最为常用的紫外一可见光度检测器在微流控分析系统中很少应用,其中的一个主要原因是它的灵敏度较低,难以实现微米尺度光程下微量物质的测定;(2)响应速度快。由于芯片上的通道一般较短,许多混合、反应及分离过程往往在很短的时间内完成(秒级甚至更短),组分流经检测器的线速很高(在毫米每秒数量级),因此要求检测器有很快的响应速度;(3)体积小,易集成化。为了实现分析仪器集成化、微型化的总体目标,微流控分析系统的检测器体积应该与方寸大小的芯片相匹配,并且容易与芯片集成于一体。然而,目前微流控分析系统采用的检测器体积均大大超过芯片的体积,而且大多为外置式,成为微流控分析系统“瘦身”的瓶颈。

完全满足以上要求的检测器并不多。目前在微流控分析中应用得最多的是激光诱导荧光检测器,其次是电化学检测器

1.激光诱导荧光检测器

我们知道,荧光物质受激发后所发出的荧光强度是与激发光的强度成正比的。因此采用高强度的激发光源,可以提高荧光检测的灵敏度,改善检出限。微流控分析系统的通道只有微米尺度,这就要求激发光能够聚焦成高强度的微米级大小的光斑,以便激发出较强的荧光。由于激光可发出高强度的相于光,能聚焦成很小的光斑,因此,在微流控分析中,大多采用激光作光源的激光诱导荧光(laserin-ducedfluorescence,LIF)检测,其检测下限一般可达到10-9一10-12mol▪L-1。

微流控分析中常见的共聚焦型LIF检测器的光学系统,主要由滤光片(只能透过具有一定宽度的特定波长的光)、二向色镜(dichromicmirror)、显微物镜、光阑、目镜和光电倍增管等组成。其中,二向色镜能让大于所选定波长的光通过而使小于该波长的光反射。一定波长的激光(如从氢离子激光器发出的488nm的激光)经过滤光片1(滤去激光器发出的其他波长的光)射到二向色镜(488nm反射/520nm通过),经二向色镜反射到显微物镜后,聚焦到芯片的检测通道上,通道内的待测组分受激发后,所发出的荧光(520nm)由显微物镜收集后,透过二向色镜,再经过光阑和滤光片2除去特定波长(520nm)荧光以外的杂散光以后,经目镜聚焦在光电倍增管上产生光电流。可见,该光学系统中,激发光的聚焦与荧光的收集采用同一个显微物镜,由此得到共聚焦的名称。

在微流控芯片分析中最常用的激光器是主要输出波长为488nm,输出光功率在2-20mW的小功率氢离子气体激光器。该激光器输出光的功率稳定、光束会聚性能好,有不少荧光探针(衍生待测物的荧光试剂)的激发波长与之匹配。但该激光器体积较大、价格较贵。近年来,半导体二极管激光器越来越多地得到普及。在分析化学中得到应用的主要有波长为635nm的红半导体二极管激光器和波长为473nm的蓝半导体二极管激光器。半导体二极管激光器具有体积小、功耗低、输出功率稳定、使用寿命长、价格相对便宜等优点,已成为微流控分析荧光检测的理想激发光源。

尽管用激光作光源具有强度大、相干性好的优点,但是多数激光器所能发射的谱线数量有限,而具有天然荧光的化合物也不多,因此可用LIF直接测定的化合物并不多。目前,在微流控分析中,用LIF测定的氨基酸、DNA、蛋白质都要经过衍生处理后才能测定。一表25-1列出了三种最常用的荧光探针试剂与它们的主要分析性能。

为了进一步缩小荧光检测器的体积,使其有可能与芯片集成在一起,人们正在探索用发光二极管为光源,雪崩光电二极管为光电转换器件的荧光检测器。

2.电化学检测器

电化学检测是一类常用的分析测试方法。不论何种电化学检测法都采用电极作为传感器,直接将溶液中待测组分的化学信号转变为电信号。这一传感方式十分符合微流控分析系统微型化、集成化的要求。因为,(1)与在芯片上加工微光学器件相比,通过MEMS技术在芯片上制作微电极并不困难;(2)与光学检测法不同,电化学传感的灵敏度并不会因为通道几何尺度的微型化而降低;(3)电化学检测器的信号处理系统等外围设备比较简单,易微型化。因此,作为微流控分析系统的检测器,电化学检测器具有其独特的优势。

根据电化学检测原理的不同,目前在微流控分析系统中所采用的电化学检测器主要有安培检测器(amperometricdetector)和电导检测器(conductivityde-tector)。此处主要介绍安培检测器。

安培检测法是在工作电极上施加一个恒定或脉冲电位,使待测物质在工作电极上发生电化学反应,通过测定所产生的氧化或还原电流对待测物进行定量的检测方法。它的灵敏度接近激光诱导荧光法,且有一定的选择性。但安培法不是一种通用的检测方法,它要求测定对象在所选用的电极上具有电化学活性。另外,安培检测的工作电极容易被污染而钝化,使稳定性下降。迄今为止,在微流控分析中,安培检测器几乎都用于芯片毛细管电泳的检测。

分离通道的终点储液池(缓冲废液池)同时也是安培检测池。池中置有由微型碳纤维圆盘工作电极、微型Ag/AgCl参比电极以及Pt丝对电极所组成的三电极体系,它与芯片外的恒电位仪和微电流测量器一起构成了安培检测系统。工作电极通过与分离通道相对的电极引导孔与分离通道的出口对准并固定于分离通道的出口处,通过恒电位仪向工作电极上施加一定的检测电位。当待测组分从分离通道中流出,扩散到工作电极表面后即发生氧化或还原反应并产生信号电流,在电泳谱图上形成一个组分峰。采用非集成式传感电极的安培检测系统的优势在于,当工作电极钝化后,可以将它从芯片上卸下进行抛光处理或化学清洗,甚至更换一支新的工作电极,而不影响芯片的使用。但是,这种形式的检测系统集成化程度不高。

目前,人们更多地致力于通过MEMS技术,将电极直接制备在芯片之上,形成集成化程度很高的芯片分析系统。图25-25(b)所示的即是将检测用的三个电极及施加分离电压用的四个电极与通道网络一起全部集成于一体的毛细管电泳一安培检测芯片,其集成化程度获得了显著的改善。然而,当电极钝化后,而原位化学或电化学清洗又不能使电极活化再生时,整块芯片只能报废。因此采用聚合物材料制备这种集成化的且可“一次性”使用的芯片,将是微流控分析的一个发展方向。

安培检测器常用于检测多巴胺和儿茶酚等神经递质、糖类、含硫化合物等生命活性物质,以及硝基(如炸药)和酚类化合物等。

3.其他类型的检测器

除了上述两种最常用检测器以外,在微流控分析中用到的其他检测器还有电导检测器、紫外一可见光检测器、质谱检测器以及化学发光检测器等。其中,电导检测器是根据带电离子对溶液电导率的贡献而进行检测。它不像安培检测器那样要求待测组分在电极上具有电化学活性,只要是离子型都有响应,是一种通用型检测器,尤其适于无机离子、氨基酸等小分子离子的检测。作为一种易于微型化、集成化的通用型检测器,它在微流控分析系统中的应用开始为人们所重视。但是,电导检测器的灵敏度比安培检测器低,受背景电解质的影响较大。

紫外一可见光检测器在高效液相色谱和常规毛细管电泳中得到了广泛的应用,但在微流控分析系统中的应用却较少。这是因为,(1)紫外一可见分光光度法测定的灵敏度与光程成正比,而微流控分析芯片的通道深度一般只在微米级,能测到的吸光度值往往只有10-4数量级甚至更小;(2)玻璃、聚合物等芯片材料对小于400nm的紫外光有很大的吸收,甚至基本不透过紫外光,而大部分的有机化合物的最大吸收波长处于200-360nm之间;(3)经湿法腐蚀刻制的玻璃通道表面粗糙,易产生较强的反射和杂散光。实践中一般采取“Z’,形通道设计,或在通道末端嫁接石英毛细管作为检测窗口等措施来增加光程,适当提高灵敏度。

质谱具有很高的灵敏度和分辨率。20世纪80年代末发明的两项“软电离”技术,电喷雾离子化(electrosprayionization,ESI)和基质辅助激光解吸离子化(MALDD,使得质谱成为多肽、蛋白质等生物大分子的结构和定量分析的主要工具,生物质谱学也应运而生。但质谱只能分析纯试样,当分析复杂的生物试样时,往往需要在质谱分析前,对试样进行预分离处理。因此,将微流控分析作为质谱分析的前处理工具,具有巨大的发展潜力。其中,ESI的流体进样方式可以较为方便地与微流控芯片在线偶联,是目前微流控芯片与质谱联用的主要形式。但质谱仪价格昂贵、体积较大,目前尚难在多数实验室中普及。

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