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动物组织提取物的制备

发布时间:2015-09-11 00:00 作者:中国标准物质网 阅读量:704

动物细胞膜非常脆弱,在机械力和渗透压的结合作用下,细胞极易破碎。因此,从大多数动物器官中提取可溶性蛋白质是很简单的。将动物器官剪碎,放人适当的缓冲液中,用匀浆器匀浆,再经过离心,混合物便会分离澄清。如提取膜蛋白,则需要更专业的方法。

器官的选择中一个很重要的因素是:由于研究细胞信号转导时,目标蛋白质的量很少,应尽可能选择含有目标蛋白质最高的器官。

(1) 动物组织预处理的一般步骤如下:

1) 首先去除器官中的脂肪和连接组织,将其切成数克重的小块,放入预冷的匀浆器中,加人预冷的提取缓冲液,体积为器官重量的2倍。

2)根据器官的坚韧程度,全速匀浆1-3 min,若需要长时间匀浆,应在匀浆数分钟后间歇1min,避免产生过多的热量,使目标蛋白质变性。

3)将匀浆液倒人烧杯中,置于冰上,搅拌15 - 30min,以使目标蛋白质充分释放。然后于4℃离心,除去细胞碎片。

4)小心地倾出离心上清液,用过滤法除去离心杯上层的脂肪物质。

(2)提取过程应注意的事项如下:

1) 匀浆方法的选择:一些动物器官,如肝脏、肾脏、脑、心脏,很容易匀浆,而另一些动物器官,如骨骼、肺,则很难匀浆,建议在匀浆前先用家用碎肉机将其打碎。高度纤维化的器官(如乳腺),在匀浆前应当先冷冻,这样有利于破碎。对于少量培养所得到的软组织和动物细胞,使用手工式匀浆器反而能更好地匀浆。

2)提取缓冲液的选择:一般来说,都应使用中性pH、适当离子强度的缓冲液,如0. 1 mol/L的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)。在静电力的作用下,一些蛋白质极易吸附到器官碎片或膜碎片上,在这种情况下,往提取物中加入0. 1 mol/L的NaCl,能够显著地提高蛋白质的回收率。

3) 抑制蛋白酶的活性:一般来说,并没有必要加入蛋白酶抑制剂,因为蛋白质粗提取物中的蛋白质浓度很高,大量的蛋白质会保护目标蛋白。但是,若目标蛋白容易降解,则需要加人蛋白酶抑制剂。另外,在一些动物器官(如肝脏)中,蛋白酶的含量要比其他器官(如心脏)中高很多,此时蛋白质降解会很严重,需要考虑添加蛋白酶抑制剂。由于蛋白酶抑制剂较昂贵,在一般情况下要尽可能避免使用。

4)保护剂的添加:一些蛋白质很容易被氧化,在这种情况下,要在提取液中加入适当的抗氧化剂。当重金属离子会抑制目标蛋白时,则需要加入EDTA (0.lmol/L)。总之,要通过预实验确定添加保护剂能否达到预期的效果,从而确定在正式实验时是否使用保护剂。

5)提取液的澄清:最常用的方法是高速离心或超速离心。若提取液中含有大量的核酸和核蛋白,会使提取液薪度增加,降低沉降速率,影响离心效果。此时可往提取液中加入适量的聚胺类物质,如精蛋白硫酸盐,搅拌适当的时间,然后再离心。聚胺类物质会引起核酸和核蛋白的聚集,使沉降更容易。所用浓度一般为g/L就足以澄清提取液,若要得到最佳条件,最好通过预实验来确定最佳浓度。另外,还可以利用超声的方法,打碎基因组DNA。

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