基因工程技术的发展为生物体生产外源蛋白展示了广阔的前景。自20世纪70年代基因工程技术诞生以来，基因表达技术已渗透到工业、农业及生命科学等领域，并已取得令人瞩目的成绩。虽然原核表达技术已十分成熟，但还存在许多难以克服的缺点，如细菌产生的致热原使表达产物难以应用于临床；目的蛋白常以包涵体形式表达，致产物纯化困难；原核表达系统的翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低。鉴于此，利用真核表达系统来表达目的蛋白越来越受到重视。目前，基因工程中常用的真核表达系统有：酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统等。由于应用酵母表达系统、昆虫表达系统和真核细胞表达系统时，所表达的蛋白被分泌到培养基中，只要通过离心除去细胞，将培养基经过浓缩即可进一步纯化目标蛋白，在此重点介绍大肠杆菌细胞中重组蛋白质的提取步骤。

(1) 大肠杆菌的酶解：

1) 4℃ 、1000g离心15 min收集细菌细胞，倒去上清液，将湿细菌称重。

2) 每克细菌细胞中加入约3 ml溶菌酶缓冲液（50mmol/L Tris·HCl，pH 8. 0；lmmol/L EDTA；50mmo1/L NaCl; lmmol/L PMSF)，涡旋，使菌体完全悬浮，加入溶菌酶，终浓度至0. 3mg/ml，于4℃搅拌30min。

3）搅拌下加入脱氧胆酸盐，终浓度至1 mg/ml。

4）加入核酸酶，终浓度至10mg/ml，搅拌下室温作用15 min。

5) 4℃、10000g离心15 min，分别收集上清液和沉淀，进行SDS-PAGE，确定目标蛋白质存在于哪个组分中，如果目标蛋白质位于沉淀中，则重组蛋白是以包涵体的形式存在。

(2）包涵体的清洗：

1) 将破菌后的沉淀重悬于适当的缓冲液中，涡旋混合5 min，离心收集沉淀。

2）将上述沉淀重悬于1％的Triton X-100中，涡旋混合5 min，离心收集沉淀。

3) 将上述沉淀重悬于4mol/L的尿素或盐酸肌中，涡旋混合5 min，离心收集沉淀。

4）将破菌后的沉淀重悬于适当的缓冲液中，涡旋混合5 min，离心收集沉淀。

根据清洗的情况，可以适当地增加2)、3)步的洗涤次数。

(3) 从包涵体中溶解重组蛋白：在溶解包涵体时，可以选用2％的SDS、8mol/L的尿素或8mol/L的盐酸肌等裂解液，根据蛋白质的特性、实验的要求进行选择，并进行优化。下面以8 mol/L盐酸肌为例，溶解包涵体中的重组蛋白质。

1）用裂解液（50mmo1/L Tris·HCl, pH 8.0, 8mo1/L盐酸胍，1mmol/L DTT）重悬清洗后的包涵体，如果重悬困难，可适当地进行超声处理，然后在室温下作用lh，并不时地涡旋混合。

2) 4℃、20000g离心30min，除去不溶性物质，保留上清。

(4）重组蛋白提取的注意事项：

1) 缓冲液的pH：使用溶菌酶破菌时，应注意所用缓冲液的pH,一般在pH 7. 0-8.0之间，0. 05mol/L的离子强度下效果较好。

2）核酸的去除：细菌提取物中大约含有40％-70％的蛋白质、10％-30％的核酸、2％-10％的多糖和10％-15％的脂肪酸。核酸会使裂解物的粘度很高，可用核酸酶将其除去。

3) 防止蛋白酶的水解：如果从细菌中提取可溶性蛋白质，需加入蛋白酶抑制剂，以防止目标蛋白质被降解；当蛋白质被包裹在包涵体中时，一般没有必要加入蛋白酶抑制剂。在裂解液和复性缓冲液中需要加入蛋白酶抑制剂，因为蛋白质处于半折叠状态时对蛋白质水解很敏感。

4）破碎方法：除了用溶菌酶可以破碎细菌细胞外，也可以使用超声破碎仪、高压细胞破碎仪等来破碎细胞。

5）重组蛋白的纯化条件：最好在变性状态下进行纯化，因为此时的蛋白质比较稳定。尿素溶液能够用于凝胶过滤层析、离子交换层析和金属鳌合层析。但盐酸肌溶液仅可用于凝胶过滤层析，而不能用于离子交换层析和金属鳌合层析，这是因为其离子会形成较大的干扰。