在选择某种样品制备方法时，首先要明确进行双向电泳所要达到的目的。比如，要尽可能看到更多的蛋白质，还是仅仅想看到样品中感兴趣的蛋白质。额外的样品制备能提高电泳最终结果的质量，但它会导致一些蛋白选择性的丢失。为了在复杂的蛋白混合物中辨别出特定蛋白，那些感兴趣的蛋白在电泳条件下必须是完全溶解的。溶解不同种类的蛋白样品，应采用不同的条件和措施：一些蛋白质在天然条件下与膜、核酸及其他蛋白质形成复合物；一些蛋白质形成各种非特异性的复合物；一些蛋白质条件变化时就会沉淀。溶解的效果取决于细胞破碎的方法、蛋白质溶解和浓缩的方法、去污剂的选择以及样品溶液的成分。在处理某种样品的时候，如果这些步骤中的任何一步没有做好，都可能使分离不完全或失败，或丢失重要信息。

为了对细胞内蛋白作完全分析，细胞必须进行有效地破碎。细胞破碎方法的选择，依赖于样品是来源于细胞、坚硬组织还是其他生物材料；是否要分析细胞内所有蛋白质，或仅仅是细胞内的一小部分蛋白质。在细胞破碎过程中，蛋白酶也可能被释放出来。蛋白质的水解增加了双向电泳结果分析的难度，因此在细胞破碎和随后的预处理中，样品必须防止被水解。如果只对组织或细胞中的一部分蛋白感兴趣，在样品制备过程中可以采取预先分流的方法。如果想要分析的蛋白质来源于细胞器（细胞核、线粒体、原生质膜），应在蛋白质溶解之前采取差速离心或其他方法进行纯化。在进行双向电泳之前，样品可以在不同的提取条件下利用溶解性进行预分离。

样品中蛋白质沉淀和干扰物质的去除是可选的步骤。是否采用这两步依赖于样品的自然特性和实验的最终结果。它可用来浓缩样品，也能用来将蛋白质从可能的干扰物中分离，减少来自样品的污染。如果样品中的污染物不被除去，污染物有可能存在于双向电泳的最后结果中，如盐离子、离子型去污剂、核酸、多聚糖、脂类及酚类化合物等。

通常对样品的处理越简单越好。例如，低蛋白高盐的样品能按常规的方法稀释和分析；可以除盐，然后利用冻干的方法将其浓缩；或利用TCA和预冷的丙酮将其沉淀，然后用再水化溶液将其再溶解。一般用再水化溶液简单地对样品进行稀释可能足够了。若蛋白质浓缩存在困难或干扰物质不能克服，有必要使用蛋白质沉淀和除杂技术。

样品溶解液的成分对双向电泳极为重要，因为对第一向电泳而进行的蛋白质溶解处理必须既不影响蛋白质的PI，其导电性也不能过高。通常使用高浓度的尿素，以及一种或几种去污剂。

样品处理原则：

1) 处理样品的方法尽量简单、尽量避免蛋白质丢失。额外的样品处理能提高双向电泳最终结果的质量，但是有可能以选择性丢失某些蛋白为代价。

2）细胞破碎的方法必须以最大限度地减少蛋白质水解和其他形式的蛋白降解为原则。细胞破碎时尽量在低温下进行，并且减少破碎过程中热量的产生。理想的情况是，细胞破碎应当直接在含有蛋白酶抑制剂的强变性溶液中进行。

3）样品溶解液应是新鲜配制的或在冷冻情况下储存，使用高纯度或去离子的尿素。

4) 等电聚焦（IEF）之前处理样品或将样品在-80℃冰箱内保存来保证样品的质量，并应避免反复冻融。

5）通过超离心方法除去所有颗粒物，固体的小颗粒必须除去，因为它们能堵塞凝胶的孔隙。

6) 为了防止蛋白质被修饰，不要在加人尿素时加热。当样品中存在尿素时，不要将样品处于37℃以上的环境中。提高温度能使尿素转化为异氰酸酯，它能对蛋白质进行修饰。