双向电泳过程中，蛋白质沉淀是可选的步骤。蛋白质沉淀可以从污染杂质（如盐、去污剂、核酸、脂类等）中有选择性地分离蛋白质，否则这些污染杂质能影响双向电泳的结果。这种方法也能将低浓度的提取液（植物组织，尿液）进行浓缩。到目前为止，尚无任何一种沉淀方法是十全十美的，有时一些蛋白质沉淀后，就不能在随后的样品溶液中重新被溶解。因此，在样品制备中，使用沉淀方法有可能改变样品蛋白的成分。如果双向电泳想要完全和精确地得到样品中的全部蛋白质，就应尽量避免使用沉淀和重新溶解的方法。若需在样品处理中进行蛋白质沉淀，一般只选用下面一种沉淀方法。

(1) 硫酸铵沉淀法 在高浓度盐存在的条件下，蛋白质有可能相互结合并从溶液中沉淀出来，许多种潜在的污染物（核酸）将会留在溶液中。应在含有EDTA的缓冲液中（> 50mmol/L）处理蛋白质，蛋白终浓度大于1 mg/ml。首先慢慢地将硫酸铵加至需要的百分饱度，并且搅拌10-30分钟，然后利用离心将蛋白质分离。最后，会有许多蛋白质仍然残留在高盐溶液中。若想得到所有蛋白质，这种方法不可取。然而，它可以用来进行预分离和蛋白质富集。残留的硫酸钱能影响等电聚焦，因此必须除去有关盐离子。

(2) TCA沉淀 TCA是一种相当有效的蛋白质沉淀剂。在提取物中加入TCA，使之终浓度为10％-20%，并且在冰浴中沉淀30分钟。也可以将组织直接在10％-20％的TCA中破碎。这种方法可以限制蛋白质水解和其他蛋白修饰反应的发生，最后离心并用丙酮或乙醇洗去残留的TCA。用这种方法处理过的蛋白质样品，部分蛋白质可能很难再溶或完全不能再溶。

(3）丙酮沉淀法这种有机溶剂常用来沉淀蛋白质。许多溶于有机溶剂的污染物（去污剂、脂类）被留在溶液中。在提取物中加入3倍体积的预冷丙酮，使蛋白质在-20℃条件下沉淀2小时。用离心法收集蛋白质，并可通过空气干燥或冷冻干燥除去残留的丙酮。

(4) TCA的丙酮溶液沉淀蛋白 在双向电泳样品制备过程中，往往用TCA和丙酮的混合物来沉淀蛋白，这种方法比单独使用TCA或丙酮效果好。将破碎或裂解的样品悬于含有20mmol/L DTT或0.07% 2-巯基乙醇的10% TCA溶液中。在-20℃条件下沉淀蛋白质至少45分钟，用离心方法收集蛋白沉淀，并且用含有0.07%巯基乙醇或20mmol/L DTT的预冷丙酮溶液清洗。通过空气干燥或冷冻干燥除去残留的丙酮。部分蛋白质可能很难重新溶解或完全不能重溶，而且长时间地将样品处于这种低pH的溶液中，能使一些蛋白降解或被修饰。

(5）乙酸铵甲醇溶液沉淀蛋白质并且用酚抽提 这种方法在处理含有大量干扰物质的植物样品时被证明是有效的。样品中的蛋白能被抽提进入水或缓冲液饱和的酚中，从酚相中用含有0. 1 mol/L乙酸铵甲醇溶液沉淀蛋白质，再用含有乙酸铵的甲醇溶液清洗沉淀数次，然后用丙酮清洗，并将残留的丙酮蒸发掉。这种方法很复杂且费时。