北京普天同创生物科技有限公司
等电聚焦(IEF)是根据蛋白质的等电点(isoelectric point, pI)不同将它们分开的一种电泳技术。蛋白质是两性分子,整个分子要么带有正电荷或负电荷,要么不带电,这依赖于环境的pH。
整个蛋白质分子的带电量取决于组成蛋白质氨基酸的侧链及C端和N端所有电荷总和。等电点是一个特定的pH,此时整个蛋白质分子的净电荷为零。蛋白质在环境pH低于PI时带正电,而高于PI时带负电。在pH梯度凝胶内,电场作用下,带正电荷的蛋白质向负极移动,通过pH梯度到达PI点位置之前,所带的正电荷会逐渐减弱。带负电荷的蛋白质则要向正极移动,所带的负电荷会逐渐减少直至为零。如果蛋白质偏离等电点,便立即带上电荷而返回等电点的位置,能将蛋白质在其等电点上浓缩,并根据所带电荷微小的差异,将蛋白质分离,这就是等电聚焦的聚焦效应。蛋白质的分离程度取决于pH梯度斜率和电场强度。因此,等电聚焦是在相当高的电压下进行的(一般超过1000V )。当蛋白质在pH梯度上都达到最终点时,在整个体系中很少有离子的移动,从而使最终电流很低(往往低于mA )。
等电聚焦在变性条件下进行,能产生高分辨率和高清晰度的结果。利用尿素和去污剂的混合液,能达到完全的变性和溶解,确保各种蛋白质以单一形态存在,并且减少凝集和分子间的相互作用。
等电聚焦(IEF)使用IPG胶条在平板电泳仪上水平进行。IPG干胶条在含有必需成分的再水化液中再水化,也可含有样品蛋白。等电聚焦是在IPG条上电压逐渐增加,至少达3500V,并且维持这个电压至少几小时。等电聚焦完成以后,IPG胶条在平衡液中平衡,随后放置到水平或垂直的SDS-PAGE(第二向)上进行电泳。
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