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蛋白沉淀是指蛋白质聚集体从溶液中的析出,通过离心可以将其分离提纯。许多方法可以使水溶液中的蛋白发生聚集,包括针对很多蛋白质的非特异沉淀方法如加盐或三氯乙酸等,以及针对某一特定蛋白的特异方法如使用抗体或其他亲和基质。用特异性抗体使溶液中某一特定蛋白沉淀析出的方法称为免疫沉淀。用免疫沉淀的手段探讨生理状态下蛋白与蛋白间相互作用的方法称作免疫共沉淀。
在生理状态下,蛋白质间的相互作用普遍存在。在细胞内,酶作用于特定底物需要蛋白质之间的相互作用。这种相互作用介导了某一特定信号的传导,如细胞分裂、分化、增殖、DNA复制和转录起始等功能的调节。在细胞外,细胞间的联系也需要蛋白质之间的相互作用,比如配体和受体的结合。免疫沉淀的条件容易控制,是一种简便快速的亲和纯化方法,在信号转导通路的研究中,被广泛地应用。
总的来说,免疫沉淀主要包括以下几个步骤:①细胞裂解及细胞抽提物的制备;②蛋白通过其抗原表位与抗体相结合;③抗原抗体免疫复合物的形成;④免疫沉淀复合物的洗涤,以及非特异性结合蛋白的去除。免疫沉淀可以在自然条件下进行,这种条件保持了酶的活性,以及生理状态下蛋白之间的相互作用;也可以在严格的条件下进行,这种条件可以减少目的蛋白的非特异性结合,但是酶的活性以及蛋白复合物有可能遭到破坏。实验过程中,根据实验目的的不同,可相应的改变实验条件。
免疫沉淀物被分离出来之后,可直接用于酶活性的测定或进行凝胶电泳分离。电泳之后,蛋白的检测可以通过细胞裂解前所作的放射性标记或者使用相应的抗体进行免疫印迹(Western blotting)分析。其中,最常用的检测方法是进行免疫印迹分析。当免疫沉淀产物的量足够大时,可对聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果进行银染或者考马斯亮蓝染色,以检测沉淀出来的目标蛋白。银染和考马斯亮蓝染色对于SDS-PAGE上蛋白质的分辨能力分别为1-10 ng和0.1-1 μg。
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