免疫沉淀的效率取决于多种因素，其中最重要的一点是抗体与抗原位点的亲和力。抗体亲和力的变化范围很大，但要维持免疫沉淀的有效进行，抗原抗体的亲和力应达到107 mol-1到109 mol-1提高抗原抗体亲和性的最简单方法是增加抗体或抗原的浓度，但这只在抗体没有饱和的情况下是有效的。要确定抗体的饱和程度，可以在一定容量的反应容器中对于固定量的抗原进行抗体滴定。当抗体的量有限时，最简单的方法是减小反应容器的容积。在实验的准备过程中，确定抗体用量，可以用少量的抗体进行十二磺基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS - PAGE)分离，根据条带与标准品光亮度的比值可计算出抗体的浓度。如果所用的是纯化抗体，可以利用它在280 nm的吸光度来确定其浓度，换算公式为：1 OD =0. 75mg/ml纯化抗体。

免疫共沉淀成功的第一步是制备可特异性识别目的蛋白的抗体。我们可以使用给蛋白加标签（tag）的方法使其被商品化的抗体或亲和试剂所识别。之后，可以通过构建标记蛋白的表达载体，将其导入宿主体内。但是，所有被标记的蛋白必须经过在体的功能检测。最为广泛使用的方法是在目的蛋白的N端或C端加上一个被称之为标签的短肽或抗原表位（epitope )。当然，在不影响其功能的条件下也可以把标签加在蛋白的内部。两种最常用的标签是来源于流行性感冒血凝素蛋白的HA,以及来源于人类核蛋白一个肽段的c-Myc，两者分别可被高亲和力的单克隆抗体12CA5和9E10所识别。其他标签如基因10引导肽和噬菌体17降解产物也经常被使用。有时可以插入串联重复的标签来提高灵敏度，串联标签的拷贝数可以由1个到3个甚至9个之多。

当要沉淀的蛋白分子量接近免疫球蛋白的重链（50kD）或轻链(23kD）时，使用短的标签不容易使其与IgG分开，这时可融合一个小蛋白或多肽，增加其相对分子质量。值得注意的是，这种小

蛋白或多肽需要能够与偶联到固相介质的小分子特异结合，比如可以与偶联到琼脂糖（Sepharose)上的谷胱甘肽结合的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)，以及可与麦芽糖亲和介质结合的麦芽糖结合蛋白（MBP）等。

免疫共沉淀成功的第二步是制备含有大量目的蛋白和高活性的全细胞抽提物。这就需要根据条件，使用可让抗体或亲和介质发挥最大效能的细胞裂解液。总的来说，细胞裂解液与免疫沉淀缓冲液的成分不应有太大的不同。全细胞抽提物中，总蛋白的回收率与活性并不能完全等同于某一特异蛋白的回收率与活性，所以在进行免疫沉淀操作之前，要对这些参数进行初步的评定。当抽提物准备好后，免疫沉淀可在3-4h内完成，之后可用于蛋白电泳及免疫印迹分析。