凝胶阻滞实验早先用于研究原核基因表达调控蛋白的多平衡动力学，Strauss将实验方法加以修改，在结合反应中加人大肠杆菌的DNA片段，从而检测到粗提物中与DNA结合的蛋白质。Singh等在实验中改用化学合成的寡核昔酸替代DNA，用于蛋白结合位点的分析。现在，凝胶阻滞实验所使用DNA探针为人工合成的寡核昔酸，片段长度在20-200bp。如果寡核昔酸片段长度过大，将增加非特异结合，因此，若结合位点较明确，可将片段长度控制在20-30bp。另外，由于DNA结合蛋白位点一般需要6-8个碱基，所以，寡核苷酸探针也不宜过短。

DNA与蛋白质形成的复合物结合半衰期较短，而实验中需要较高电压（225 - 250V）电泳较长的时间（2h)。在实验中，由于各种因素的共同作用，可以使复合物保持稳定。其中选用缓冲液为0.5×TBE，为低离子强度，可以增加复合物的稳定性。聚丙烯酞胺凝胶可以提供一种限制性的特定环境，使复合物分解后不能扩散从而再度结合。

为了减少蛋白质与寡核昔酸探针的非特异结合，实验中一般加入1μ1 poly ( dI-dC) (20μl反应体系）可以明显减少非特异性结合反应。但如果使用过量，它又可以抑制寡核昔酸探针与蛋白质的特异性结合。poly ( dI-dC）作用是作为非特异竞争性抑制剂。非特异竞争性抑制剂应与探针的特异结合位点有较大差异，否则将影响特异结合。例如特异结合位点为GCGCGC序列，应避免实验中使用poly ( dG-dC)，而应改用其他竞争性抑制剂。若结合位点不能确定，则在预实验中选用多种竞争性抑制剂来进行。鮭精DNA也可以作为非特异竞争性抑制剂，降低探针-DNA的特异结合。

凝胶阻滞实验可通过与探针完全相同的非标记DNA片段来评价蛋白与DNA结合的特异性。非标记DNA片段与标记探针竞争与蛋白质的结合，随着非标记DNA片段浓度的增加，探针与蛋白结合减少，实验中通常添加的非标记DNA的浓度远远大于探针浓度（50-100倍），会使探针与蛋白质的特异结合带完全消失。实验中一般会设计一个阴性对照，即非标记DNA片段序列中不含有蛋白质特异结合位点，其浓度变化不影响探针与蛋白质带的变化，提示为特异结合反应。
凝胶阻滞实验与免疫学相结合用于鉴定DNA结合蛋白质特异性的Super Gel Shift实验也使用较广，其基本原理为：蛋白质与其抗体结合后，再与探针结合，形成抗体-蛋白质- 探针复合物，由于三联复合物分子量大于蛋白质- 探针二联复合物，在聚丙烯凝胶中的区带更滞后，从而证明蛋白质结合带特异性。实验中由于抗体的加入，有时会影响蛋白质与探针的结合，一旦影响其与探针结合，在Super Gel Shift实验中不会出现区带更滞后，而是出现区带信号变弱，同样可以证明蛋白质结合带的特异性。

凝胶阻滞实验除可观察DNA与蛋白质形成的复合物，还可以检测与RNA特异结合的蛋白质，即RNA凝胶阻滞实验，但由于RNA易于降解，实验难度较大。凝胶阻滞实验中探针一般用32 P标记，现在随着技术进步，用荧光标记探针可使实验简化的同时，并缩短了实验周期。