到目前为止，较为常用的方法有通过化学合成、体外转录、长片段dsRNAs经RNase III类降解等体外制备siRNA，以及通过siRNA表达载体或者病毒载体，PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达产生siRNA。

(1) 化学合成许多国外公司都可以根据用户要求，提供高质量的化学合成sIRNA。但价格高、定制周期长，特别是有特殊需求的，很难得到满意的合成。由于价格比其他方法高，为一个基因合成3-4对siRNAs的成本就更高了，比较常见的做法是用其他方法筛选出最有效的序列，再进行化学合成。此方法适用于已经找到最有效的siRNA的情况下，需要大量siRNA进行研究，但不太适用于筛选siRNA的研究。

(2）体外转录以DNA Oligo为模板，通过体外转录合成siRNAs,成本相对化学合成法比较低，而且能够比化学合成法更快地得到siRNAs。不足之处是实验的规模受到限制，虽然一次体外转录合成能提供足够做数百次转染的siRNAs，但是反应规模和量始终有一定的限制。体外转录得到的siRNAs毒性小，稳定性好，效率高，只需要化学合成的siRNA量的1/10，就可以达到化学合成siRNA所能达到的效果，从而使转染效率更高。此方法最适用于筛选siRNAs，特别适用于需要制备多种siRNAs的实验。当实验大量需要一个特定的siRNA时，该方法就不太适用了。

(3）用RNase III消化长片段双链RNA制备siRNA以上制备siRNA方法的缺陷是需要设计和检验多个siRNA序列，以便找到一个有效的siRNA。而制备一份含有各种siRNAs的混合物，就可以避免这个缺陷。通常选择是200-1000bp靶mRNA模板，用体外转录的方法，制备长片段双链RNA，然后用RNase IR (or Dicer）在体外消化，得到一种siRNAs混合物。在除掉没有被消化的dsRNA后，这个 siRNA混合物就可以直接转染细胞，方法和单一的siRNA转染一样。由于siRNA混合物中，有许多不同的siRNAs，通常能够保证目的基因被有效地抑制。该方法主要优点在于可以跳过检测和筛选有效slRNA序列的步骤，不过
这种方法的缺点也很明显，就是有可能引发非特异的基因沉默，特别是同源或者是密切相关的基因。因此，该方法最适用于快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型，不适用于长时间的研究项目，或者是需要一个特定的siRNA进行研究的情况。

前面的3种方法主要都是体外制备siRNAs，并且需要专门的RNA转染试剂将sIRNAs转到细胞内。而siRNA表达载体和基于PCR的表达框架这两种方法，其原理是使转染到细胞的DNA模板在体内转录得到siRNAs。这两种方法的优点在于不需要直接操作RNA。

(4) slRNA表达载体 多数的siRNA表达载体依赖3种RNA聚合酶Ⅲ启动子中的一种，操纵一段小的发夹RNA (short hairpin RNA,shRNA）在哺乳动物细胞中的表达。这3类启动子包括人源和鼠源的U6启动子和人Hl启动子。RNA pol III启动子可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子RNA，而且它是通过添加一串（3到6个）U来终止转录的。要使用这类载体，需要订购2段编码短发夹RNA序列的DNA单链，克隆到相应载体的pol III启动子下游。该方法得到的重组体需要经过测序以保证克隆的序列是正确的。siRNA表达载体的优点在于可以进行较长期研究。

病毒载体也可用于siRNA表达，其优势在于可以直接高效率感染细胞进行基因沉默的研究，避免由于质粒转染效率低而带来的种种不便，而且转染效果更加稳定。该方法最适用于已知一个有效的siRNA序列，需要维持较长时间的基因沉默。由于克隆和测序等步骤较为费时，所以该方法不适用于筛选siRNA序列。

(5 ) siRNA表达框架 siRNA表达框架（siRNA expression cassettes, SECs）是一种由PCR得到的siRNA表达模板，包括一个RNApol III启动子，一段发夹结构siRNA，一个RNA pol Ⅲ终止位点，能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。与siRNA表达载体不同的是，SECs不需要载体克隆、测序等颇为费时的步骤，可以直接由PCR得到。因此，SECs成为筛选sIRNA的最有效工具，甚至可以用来筛选在特定的研究体系中启动子和，iRNA的最适搭配。如果在PCR两端添加酶切位点，那么通过SECs筛选出最有效的siRNA后，可以直接克隆到载体中构建siRNA表达载体。构建好的载体可以用于稳定表达siRNA和长效抑制的研究。但这个方法的主要缺点是PCR产物很难转染到细胞中。因此，该法最适用于筛选siRNA序列，在克隆到载体前筛选最佳启动子。不太适用于长期抑制研究。