体内表达siRNAs是近来广泛采用的方法。目前体内表达的方法主要是载体表达（质粒载体、腺病毒载体）与siRNA表达框表达。这两种方法的核心原理都是将siRNAs对应的DNA模板插入载体或表达框中，位于RNA聚合酶IQ启动子的下游，在RNA聚合酶的作用下转录产生含发夹结构，并以一串U结尾的siRNA，利用该siRNA抑制基因的表达。现以构建U6启动子启动的 siRNA表达载体为例进行说明。另外阳离子脂质体在真核细胞转染中的应用非常广泛，且该方法比较简单。因此，本试验也将应用这种方法将重组质粒转染进目的细胞内。

材料

与mRNA靶序列一致和互补的寡核苷酸序列；piGENETM hU6质粒；MinElute凝胶提取试剂盒（Qiagen) ; MinElute PCR纯化试剂盒（Qiagen)；高效连接试剂盒（Takara )；细菌碱性磷酸酶(BAP）或牛小肠碱性磷酸酶(CIAP)；BspM I限制性内切酶及反应缓冲液（TOYOBO)；LIPOFECTAMINE 2000（INVOTROGENE)。

操作步骤

(1) 体内表达siRNA所需双链寡核昔酸的合成确定靶序列之后，根据要求合成两条单链寡核苷酸。

(2）单链寡核苷酸融合生成双链合成所需各条单链寡核苷酸后(20D)，将每组序列相应的两条单链融合生成双链寡核昔酸。

1) 用100-150mmol/L NaCl溶液分别溶解两条单链寡核苷酸至100μmol/L。

2）取0. 5ml小离心管，加入两条单链寡核苷酸溶液各2.5μl，混匀，离心。

3）将该混合物99℃水浴2 min，迅速降温至72℃，从72℃梯度降温至4℃。瞬时离心5秒，轻轻混匀。将退火的寡核苷酸1 : 200稀释，取1μl以备连接，其余-20℃保存备用。

(3）制备质粒表达载体

1) BspM I消化3-5μg piGENETM hU6质粒，37℃酶切过夜。载体piGENETmhU6在U6启动子下游有两个BspM I酶切位点，BspM I是一种限制性内切酶，利用这一特性可以将siRNA编码的序列插到U6启动子后面。

2) 1％琼脂糖凝胶分离酶切后的载体，用凝胶提取试剂盒提取回收DNA。

3）用BAP/CIAP将回收的载体DNA去磷酸化。BAP去磷酸反应混合物（100 μ1）包含BspM I消化的载体DNA (3 μg )，1×BAP缓冲液，BAP酶（3-5U)、65℃孵育1h。

4）应用MinElutePCR纯化试剂盒纯化DNA，最后溶解于30μl去离子水中，取1 μl以备连接。

(4）双链寡核苷酸克隆人质粒载体混合1μl质粒、1μl插入DNA和2μ1 ligation buffer, 16℃孵育30min。

(5）连接反应物转化大肠埃希菌宿主细胞（如DH5 a )，并在含氨节青霉素的LB培养板上挑选菌株。

(6）用质粒小量制备法，从细菌克隆中提取重组质粒。

(7）应用PCR扩增以及测序的方法对重组质粒进行鉴定。

(8) 将测序鉴定正确的质粒，应用LIPOFECTAMINE 2000转染到目的细胞内，具体操作步骤如下：

1) 转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染次日密度为90%。细胞铺板在0. 5 ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。

2）对于每孔细胞，使用50μl无血清培养基稀释0.8-1. 0μgDNA，5min。

3)对于每孔细胞，使用50μ1无血清培养基稀释1-3 μ1 LIPO-FECTAMINE 2000试剂，5 min。

4) 混合稀释的DNA和稀释的LIPOFECTAMINE 2000，在室温20min。

5) 移去细胞培养板内的含血清的正常生长培养基，替换为0. 5m1无血清培养基。

6) 直接将混合物放入每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。

7）在37℃、5%CO2的培养箱中培养，4-5h后将无血清培养基更换为含血清培养基。

8) 在细胞中加入复合物24-72h后，分析细胞抽提物。