DNA突变及构建报告基因载体

采用重叠延伸的方法，通过PCR分别对靶位点的序列进行突变。根据各个突变位点，设计、合成突变位点的特异性引物。然后，利用测序正确的野生型报告基因质粒作为模板，经过两次PCR逐个对目的序列进行突变。突变片段经过回收、酶切、连接、转化等步骤，被分别克隆到pGL3-Basic报告基因载体中（具体方法同野生型的构建），构建好的质粒经酶切鉴定后，送公司测序。

转染细胞及低氧处理

(1) 将HeLa细胞在35 mm培养皿中培养，生长至50％-80%。

(2）取100 μl无血清、无抗生素的DMEM，加入1. 5ml的Eppen-dorf管中，并向内加入10μ1脂质体（LipofectAMINETm Reagent)，静置40min。

(3）取100 μ1无血清、无抗生素的DMEM，加入1. 5ml的Eppendorf管中，向内加入2μl pGL3-靶基因重组体或载体pGL3-basic，或2μl的水静置30min。

(4）将步骤2和3的液体混合，静置15min。

(5）加入800μl无血清、无抗生素的DMEM，混匀。

(6）吸弃35 mm培养皿中的DMEM，并用1 ml无血清、无抗生素的DMEM洗涤一次，弃液。

(7）将步骤5中的1 ml混匀液体，加入35 mm培养皿中，培养5h。

(8）吸弃无血清、无抗生素的DMEM，用含15％血清的DMEM 1 ml洗涤2次。

(9）加入含15％血清的DMEM l ml，培养16h。

（10）细胞在低氧条件下，培养36h。

裂解细胞

（1) 吸弃培养基。

(2）轻轻加入足够量的PBS，洗去没有贴壁的细胞和残余培养基。

(3）加入100微升／孔（24孔板）1 ×PLB，室温摇床摇15 min。

(4）取上清进行检测。

荧光素酶活性测定

（1）测定前，提前30min打开TD20/10进行预热。

(2）首先向流式管中，加入40 μ1 LAR II。

(3) 然后加入20μl PLB细胞裂解液，枪头混匀。

(4）迅速将管插入机器，测定萤火虫荧光素酶活性。

(5）将管拿出，再加入40μl Stop&Glo，枪头混匀。

(6) 迅速将管插入机器，测定海肾荧光素酶活性。

典型实验结果。