高效液相色谱测定血清甘油三酯的研究——一种参考方法的建议

　　关键词： 高脂血症；甘油三酯类；色谱法；高压液相

　　 【摘要】目的　建立特异、精密的血清总甘油和游离甘油测定方法，以便甘油三酯测定标准化。方法　以1，2，4-丁三醇作内标，用柱前衍生高效液相色谱技术分析血清皂化前后的甘油含量(两者分别代表血清游离甘油和总甘油浓度)。结果　测定总甘油相对不精密度小于2%，游离甘油小于4%；总甘油平均回收率100.0%，游离甘油99.7%，与同位素稀释/质谱法的相对偏差不大于±2%。结论方法特异、精密、简单，可望用作血清甘油三酯测定参考方法。

High performance liquid chromatography for determination of serum total and free glycerol

CHEN Wenxiang, WANG Shu, DONG Jun, et al.

　　Beijing Hospital, Beijing Institute of Geriatrics, Beijing 100730, China

　　 【Abstract】Objective　To establish a method for measuring serum total glycerol (defined as the sum of tri-, di- and monoglycerides plus free glycerol) and free glycerol that is sufficiently specific and precise for use as a reference method. Methods　For measuring total glycerol, serum was mixed with 1,2,4-butanetriol (internal standard), saponified with alcoholic sodium hydroxide and deproteinized with sodium tunstate and sulfuric acid. The triols were then benzoylated in aqueous sodium hydroxide and analyzed by liquid chromatography. For free glycerol, serum mixed with the internal standard was directly deproteinized and the triols were derivatized and analyzed for total glycerol. Results　The total glycerol procedure showed coefficients of variation (CVs) of less than 2% and free glycerol of less than 4%. The analytical recoveries ranged from 99% to 101%. There were no significant interferences in the measurements. Conclusion　The precision and specificity of the simple liquid chromatographic method for measuring serum total and free glycerol may be used as a candidate for serum triglycerides assays.

　　 【Key words】Hyperlipidemia；Triglycerides；Chromatography, high pressure liquid

　　血清甘油三酯（TG）是一个重要血脂指标。虽然TG升高作为动脉粥样硬化性心血管病危险因素一直存有争议，但近年来随着对富含TG脂蛋白残粒和小而密低密度脂蛋白致动脉粥样硬化作用研究的深入，人们已开始重新认识TG在心血管病发生与发展中的重要性^［1-3］。在以Friedewald公式计算低密度脂蛋白胆固醇时也必须有不含甘油的TG准确测定值^［4，5］。因此，准确测定血清TG不仅用于高脂血症诊断而且在心血管病防治中具有重要意义。

　　目前血清TG常规测定普遍采用简便的酶法，影响测定准确性的因素较多^［6，7］，要使测定结果具有横向和纵向可比性，必须做到TG测定标准化^［8］。标准化工作需要可靠、方便的参考方法。目前绝大多数TG酶法测定是总甘油（定义为TG和游离甘油及少量甘油一酯和甘油二酯之和）测定，但有时需测定真正意义上的TG^［9］。测定真正TG的方法有两种，一种是同时测定总甘油和游离甘油，计算TG（外空白法）；另一种是用两步法直接测定TG（内空白法）^{［10，11］}。因此TG参考方法应至少能准确测定总甘油、TG和游离甘油三种被测物中的两种，这样才能满足各种TG测定的标准化要求。目前国际上没有公认的血清TG测定参考方法，美国疾病控制与预防中心的内部参考方法是化学法，该法采用的是Carlson和Wadstrom^{［12，13］}、Van Handel和Zilversmit^［14］及Lofland^［15］的方法和技术，特异性好，但操作复杂，技术要求高，且只限于测定TG。至于同位素稀释/气相色谱/质谱法^［16-19］，测定费用昂贵，样品处理冗长，难以推广应用。

　　鉴于以上情况，我们对高效液相色谱测定血清TG进行了细致研究，建立了特异、精密简单的血清总甘油和游离甘油测定法。

　　材料和方法

　　1. 化学试剂：用作标准物质的甘油（标示纯度99.9%）购自Sigma（St. Louis，MO，美国），经与美国标准与技术研究所的TG标准物质SRM 1595［三软脂酸甘油酯，纯度(99.5±0.2)%］比较，其纯度不低于99.5%。用作内标的1，2，4-丁三醇为Fluka（Buchs, 瑞士）产品。本研究使用的其他试剂如下：苯甲酰氯和辛基硫酸钠（Sigma产品），正己烷和异丙醇（色谱纯，Labscan, Bangkok, 泰国），乙腈（色谱纯，浙江省黄岩化工实验厂），氢氧化钠、硫酸和钨酸钠（分析纯，北京化工厂）。

　　2. 血清样品：本研究样品为不同TG浓度的新鲜人血清和冰冻混合人血清（-20℃保存），评价方法准确性使用美国标准与技术研究所标准物质SRM 1595（冰冻人血清，水平I和II）。

　　3. 标准溶液和内标溶液配制：精密称取甘油适量，用含20%异丙醇的水溶解和稀释，制备浓度为0.565、1.129、2.259、3.388和4.517 mmol/L (50～400 mg/dl三油酸甘油酯)的标准溶液，用于总甘油测定; 制备浓度为0.028、0.056、0.113、0.226和0.339 mmol/L(2.5～30 mg/dl三油酸甘油酯)的标准溶液，用于游离甘油测定。称取1，2，4-丁三醇适量，用水溶解和稀释，制备2.5 mmol/L的内标液用于总甘油测定，制备0.25 mmol/L的内标液用于游离甘油测定。

　　4. 样品制备：(1) 总甘油测定：精密取血清或标准溶液0.1 ml，加内标溶液0.1 ml、1 mol/L氢氧化钠0.2 ml和异丙醇0.6 ml，混匀，置50℃水浴中温育30 min。加0.33 mol/L硫酸0.6 ml、0.3 mol/L钨酸钠0.3 ml，充分混合后离心。取上清液0.2 ml，加8 mol/L氢氧化钠0.2 ml，置沸水浴中加热15 min。加1%辛基硫酸钠0.1 ml、苯甲酰氯80 μl和正己烷0.5 ml，在旋涡式混合器上快速混合15 min。取正己烷层用于色谱分析。(2) 游离甘油测定：精密取血清或标准溶液0.1 ml，加内标溶液0.1 ml，混匀，加0.33 mol/L硫酸0.1 ml、0.3 mol/L钨酸钠0.1 ml，充分混合后离心。取上清液0.2 ml，按上述过程进行衍生。

　　5. 色谱分析和计算：采用由HP 1100系列单元泵、自动进样器、紫外检测器和化学工作站组成的高效液相色谱仪（Hewlett Packard, Waldbronn, 德国）进行色谱分析。色谱柱为Spherisorb苯基柱5 μm，4.6 mm (150 mm）（大连依利特科学仪器公司填装），流动相为含1%异丙醇和0.5%乙腈的正己烷，流速1.2 ml/min，检测波长230 nm。取样品制备中的正己烷层直接进样，测定总甘油时进样体积5 μl，测定游离甘油时10 μl。将标准溶液的浓度对甘油/内标峰面积比进行线性回归，得回归方程，用于样品甘油浓度计算。

　　结果

　　本法是用内标法定量的色谱分析方法，测定总甘油的原理是用氢氧化钠异丙醇溶液水解TG为游离甘油和脂肪酸，用钨酸钠-硫酸试剂沉淀蛋白质，将溶液中的甘油和内标在氢氧化钠水溶液中苯甲酰化，用正己烷提取苯甲酸酯，用液相色谱分离和检测；测定游离甘油的原理是用钨酸钠-硫酸试剂沉淀血清蛋白，以脂蛋白形式存在的TG同时沉淀，将甘油和内标衍生后进行色谱分析。血清总甘油和游离甘油测定的色谱图见图1。

1.甘油，2.内标(1，2，4-丁三醇)

1　高效液相色谱测定血清总甘油(A)和游离甘油(B)色谱图

　　用本法测定4种血清的总甘油5次，5种血清的游离甘油4次，每次每种血清重复测定2份，以考查本法的精密度。测定结果总结于表1。总甘油测定的批内、批间和总变异系数（CV）分别为0.5%～1.3%、0.5%～1.6%和0.7%～2.0%，游离甘油测定的上述CV分别为1.3%～2.6%、0.7%～2.4%和1.7%～3.2%。用本法在10个月期间内测定一种冰冻混合人血清总甘油（1.42 mmol/L）22次，在6个月期间内测定另一种冰冻混合人血清游离甘油（0.11 mmol/L）14次，以观察本法的长期稳定性。两种测定的总CV分别为1.7%和2.0%。

表1　高效液相色谱测定血清总甘油和游离甘油的精密度

　　^*　测定次数5，每次测定每种血清的重复测定数2

　　^**　　测定次数4，每次测定每种血清的重复测定数2　　用本法测定血清加入已知浓度甘油前后的总甘油和游离甘油，以试验方法的回收率。总甘油测定时甘油的加入量为1.129 mmol/L和2.259 mmol/L，游离甘油为0.113 mmol/L和0.226 mmol/L。总甘油测定的回收试验进行7次，游离甘油6次。结果总结于表2。两种测定的平均回收率分别为100.0%和99.7%。

表2　高效液相色谱测定血清总甘油和游离甘油的回收率

　　^*　试验次数7　^**　试验次数6　　将几种常见多羟基化合物在本试验条件下进行苯甲酰化和色谱分离，检查它们是否干扰甘油测定。甘油、内标及相邻多羟基化合物的保留时间和分离度列于表3。常见多羟基化合物都与甘油和内标分离良好。

表3　常见多羟基化合物的高效液相色谱分离

　　用本法测定NIST的SRM 1591a（水平1和水平2）的总甘油，以进一步检查本法测定血清总甘油的准确性。本法测定结果分别为1.148和1.939 mmol/L(测定次数3，每次重复测定数2)，与NIST决定性方法测定值(1.135 7和1.947 7 mmol/L)的相对偏差分别为1.3%和-0.4%。

　　数10次实验结果显示本法中甘油浓度与甘油/内标峰面积比之间的线性相关系数大于0.999 5。

　　讨论

　　拟用作参考方法的分析方法应具有足够的准确性和可操作性。准确的方法首先应是精密的方法，本法测定总甘油的总CV小于2%，游离甘油小于4%，精密度优于化学法（2%～6%）^［9］。回收率是方法准确性的重要指标，回收试验结果表明本法测定总甘油和游离甘油的平均回收率分别为100.0%和99.7%。回收率不能揭示的影响准确性的因素包括甘油及内标色谱峰中是否含其他物质和TG水解是否完全（总甘油测定）。本法中的衍生过程除去了绝大多数与甘油测定无关的血清物质，有可能影响甘油和内标色谱分析的只有多羟基化合物，而绝大多数多羟基化合物在本色谱条件下与甘油和内标分离良好。本研究曾试验血清TG在50°C 0.2 mol/L氢氧化钠异丙醇溶液中的水解，TG可在10 min内水解完全，本法水解时间选用20 min。在此条件下，磷脂被水解为磷酸甘油，但磷酸甘油不被进一步水解。测定SRM 1591a的结果也证明本法不存在明显影响准确性的因素。

　　本法的柱前衍生采用羟基化合物在氢氧化钠水溶液中的苯甲酰化反应，样品制备非常简单。色谱法分析甘油需将甘油转化为易于色谱分离和检测的衍生物，常用的羟基化合物柱前衍生反应是在无水条件下以有机碱作催化剂的酯化反应，但甘油是一种亲水性小分子化合物，从生物样品中提取和在无水条件下衍生甘油都十分困难。醇类化合物在氢氧化钠水溶液中的酯化反应是一个多世纪前就已提出的化学反应（Schotten-Baumann反应），但此反应与无水条件下的酯化反应比，回收率和重现性差，极少用于色谱分析中的柱前衍生。本研究对甘油和不同内标在氢氧化钠水溶液中苯甲酰化的各种影响因素（苯甲酰氯用量、氢氧化钠溶液浓度、蛋白质存在与否、提取溶剂种类、表面活性剂存在与否等）作了大量、细致的研究，建立了具有如下特点的苯甲酰化过程：（1）绝对回收率与无水条件下的苯甲酰化相当；（2）以1，2，4-丁三醇作内标，苯甲酰化过程的不精密度小于0.5%；（3）反应一步完成，比无水条件下的苯甲酰化简单。

　　本法中甘油和内标的色谱分离采用苯基柱上的正相洗脱，单次色谱分析时间短于5 min。反相色谱难以分离甘油和内标，硅胶柱上的正相洗脱不够稳定。

　　本法选择总甘油和游离甘油作被测物的主要原因是简化操作。简便的总甘油和游离甘油样品制备已如前述，测定总甘油和游离甘油还避免了TG提取过程，可直接使用1，2，4-丁三醇作内标，不必合成1，2，4-丁三醇的三脂肪酸酯。

　　本法有以下特点：（1）在国际上首次用高效液相色谱准确测定血清游离甘油和总甘油；（2）在国际上首次将Schotten-Baumann反应有效地用于生物样品中甘油的柱前衍生，使色谱法分析甘油的样品制备大大简化；（3）方法的应用范围、精密度和易操作性优于化学法。

　　基金项目：卫生部科研基金资助项目（96-1-098）；1997年度默沙东科研基金资助项目

参考文献

　　1　李健斋，董军. 冠心病脂蛋白谱研究进展. 中华医学检验杂志，1997，20：327-329.

　　2　李健斋，王抒. 低密度脂蛋白、脂蛋白（a）与冠心病.中华医学检验杂志，1999,22:5-8.

　　3　Havel RJ.Plasma triglycerides and the clinician: time for reassessment. J Am Coll Cardiol,1998,31: 1258-1259.

　　4　Friedewald WT, Levy RI, Frederickson DS. Estimation of the concentration of low-density lipoprotein cholesterol in plasma, without use of ultracentrifuge. Clin Chem, 1972, 18: 499-502.

　　5　王抒，李红霞，李健斋. 血清低密度脂蛋白胆固醇直接测定与Friedewald公式计算结果比较. 中华医学检验杂志，1995，18：16-18.

　　6　李健斋. 血浆（清）甘油三酯测定方法综述.中华医学检验杂志，1987，10：119-125.

　　7　Klotzsch SG, McNamara JR. Triglyceride measurements: a review of methods and interferences. Clin Chem, 1990, 36: 1605-1613.

　　8　李健斋. 提高血脂、脂蛋白检验水平的意见. 中华医学检验杂志，1994，17：5-6.

　　9　Stein EA, Myers GL. National cholesterol education program recommen-dations for triglyceride measurement: Executive summary. Clin Chem, 1995, 41: 1421-1426.

　　10　Ruddel M, Elin RJ, McClean S. A method for the determination of triglycerides with automatic subtraction of the glycerol blank. Clin Chem, 1983, 29: 1226-1228.

　　11　杨昌国执笔. 中华医学检验学会血脂测定推荐方法（三）血清甘油三酯测定二步酶法（草案）. 中华医学检验杂志，1995，18：249-251.

　　12　Myers GL, Cooper GR, Henderson LO, et al. Standerdization of lipid and lipoprotein measurement. In: Rifai N, Warnick GR, Dominiczak MH eds. Handbook of Lipoprotein Testing. AACC Press: Washington DC, 1997. 223-250.

　　13　Carlson LA, Wadstrom LB. Determination of glycerides in blood serum. Clin Chim Acta, 1959, 4: 197-205.

　　14　Van Handel E, Zilversmit DB. Micromethod for the direct determination of triglycerides in serum. J Lab Clin Med, 1957, 50: 152-157.

　　15　Lofland HB. A semiautomated procedure for the determination of triglycerides in serum. Anal Biochem, 1964, 9:393-400.

　　16　Bjorkhem I, Blomstrand R, Svenson L. Determination of serum triglycerides by mass fragmentography. Clin Chim Acta, 1976, 71: 191-198.

　　17　Siekmann L. Reference methods for total cholesterol and total glycerol. Eur J Clin Chem Clin Biochem, 1991, 29: 277-279.

　　18　Bernert JT, Bell CJ, McGuffey JE, et al. Determination of “free” glycerol in human serum reference materials by isotope-dilution gas chromatography-mass spectrometry. J Chromatogr, 1992, 578: 1-7.

　　19　Ellerbe P, Sniegoski LT, Welch MJ. Isotope dilution mass spectrometry as a candidate definitive method for dertermining total glycerides and triglycerides in serum. Clin Chem,1995,41:397-404.

-------------------------------------------------------------------------------

作者：陈文祥　王抒　董军　李健斋　莫培生