一、无菌操作理念

（一）无菌操作概念

用于防止微生物进入人体组织或其他无菌范围的操作技术称为无菌操作。在各种生物实验中，为了防止微生物的生长和繁殖影响实验的进行，也要在相对无菌的条件下进行。

无菌操作一般需要超净工作台辅助。正常使用时，超净工作台内的空气洁净度级别为A级，因此，只能提供相对无菌的操作环境，要达到无菌的效果，还需要辅助以良好的无菌操作习惯和操作方法。

（二）消毒和灭菌有关术语

下面是无菌操作中较常用的术语：

抗菌剂：能够杀死微生物或抑制它们生长和繁殖的制剂。

防腐剂：能够抑制微生物生长和繁殖但不足将其杀灭的物质。防腐剂经常应用于体表。

生物杀灭剂：所有能够杀死生物体的制剂的统称。

化学杀菌剂：用于杀死微生物的化学品或化学混合物。

清除污染：去除和／或杀死微生物的任何过程。该词也用于去除或中和有危害的化学品和放射性物质。

消毒剂：用于杀死常见病原微生物的化学品或化学混合物，但不一定杀死芽孢。

消毒：杀死常见病原微生物的物理或化学手段，但不一定杀死芽孢。

灭菌剂：能够杀死微生物的化学品或化学混合物。该词常常可以代替“生物杀灭剂”、“化学杀菌剂”或“抗菌剂”。

杀孢子剂：用于杀死微生物和抱子的化学品或化学混合物。

灭菌：杀死和／或去除所有微生物及其抱子的过程。

（三）常用消毒剂

1.70％酒精

杀菌效果最好的酒精浓度为70%，考虑到实际使用状况，一般购买75％的商品，即消毒酒精,或用纯水稀释无水乙醇到75％使用。一般分装于喷壶内，使用时以喷雾的形式对物品消毒，再使用干净纱布擦拭。

2．酒精棉球

通常用医用脱脂棉自制棉球，或购买成品医用脱脂棉棉球。将该棉球保存于75％酒精中备用，液体量以足够棉球吸附即可。

3.0.1％-0.5％新洁尔灭溶液

手表面消毒，消毒抹布浸泡，地面消毒时拖把浸泡使用。

4．外科手消毒夜

用于手部皮肤消毒。

二、无菌操作

（一）无菌操作方法

在执行无菌操作前，必须明确物品存放的无菌区和非无菌区。穿戴好洁净服和帽子、洗手，通过风淋通道进入洁净间。

在执行无菌操作前，还需将双手用消毒酒精等消毒剂进行消毒，手上的液体在超净工作台内通过风淋使其干燥。
无菌操作中夹取无菌物品时，必须使用无菌持物钳（辅料镊、增竭钳等）。

进行无菌操作过程中，凡未经消毒的双手，均不可直接触碰无菌物品或超越无菌区取物。穿戴防护手套时也需消毒手套表面。

无菌物品（培养液、缓冲溶液、试剂、培养板等）必须保存在无菌容器或无菌包内，不可暴露在超净工作台内空气中过久。无菌容器应在无菌包一经打开即不能视为绝对无菌，应尽早使用。无菌物品与非无菌物品应分别放置。凡已取出的无菌物品虽未使用也不可再放回无菌容器内。

进行细胞影像等数据采集时，先取出细胞培养板，擦去板外粉尘，在倒置显微镜下镜检时，不能打开培养板的盖子，防止染菌。

（二）无菌操作的条件准备与维护

在洁净间内使用的洁净工作服，需定期进行清洗、消毒灭菌，使用周期内的工作服需注意防潮、防尘、防污，不使用时应按序摆放整齐。

每次使用洁净间后，应用湿拖把拖地一次或用吸尘器吸尘，防止粉尘堆积，对环境造成污染。洁净间使用前后，分别用移动紫外消毒车或室内紫外灯对室内空气和仪器表面、试验台台面和地面进行一次消毒。

进行无菌操作时，必须正确使用超净工作台。超净工作台在使用前、后均需分别进行消毒剂擦抹除尘和紫外消毒。紫外灯消毒时间30.40min，期间务必开启风淋，关闭照明，最好将超净工作台所在的整个洁净间的照明关闭，窗帘拉上，以达到最大的紫外消毒效果。

超净工作台台面等维护合理。每次使用后用消毒液浸泡的湿抹布擦抹台面粉尘，长时间不使用超净工作台也应定期用消毒液浸泡的湿抹布擦抹台面粉尘。定期擦抹照明灯管和紫外灯管上可能存在的微尘，以便保证充足的照明效果和充分的消毒灭菌效果。

每次镜检操作前需对倒置显微镜载物台、实验台面用消毒剂擦抹除尘消毒。

定期用消毒酒精擦抹CO2培养箱内、外表面，或使用其他方式对CO2培养箱内表面进
行消毒。

（三）动物细胞培养的无菌操作规程

(1)操作者正确穿戴洁净服、口罩和帽子。每次通过风淋通道风淋5-15s后进入洁净间。

(2)检查超净工作台内的物品摆放，用消毒酒精擦拭粉尘。取出培养用液放于实验台平衡温度至室温。

(3)打开洁净间和超净工作台的紫外灯，消毒30-40min。注意关闭日光灯和洁净间的窗帘，以免消毒效果低下。开启洁净间换气装置。注意，超净工作台的紫外消毒有两种方式：①部分洁净空气内循环的超净工作台，可以在开启紫外的同时开启风淋。②无洁净空气内循环的超净工作台，在开启紫外的时可不开启风淋，但需注意防止外部粉尘在紫外照射期间扩散到超净工作台内部。

(4)进入洁净间前先关闭洁净间紫外灯。到达消毒时间后，关闭超净工作台紫外灯，开启照明灯，打开无洁净空气内循环的超净工作台风淋开关，风淋30min以上再行使用，以排尽臭氧。无论何种超净工作台，在无菌操作的全过程，务必开启风淋。超净工作台一般设计有高、低档风速提供操作者选择。风淋的速度选择是由实际风量大小决定的。风量足够大时选择低速档，否则选择高速档。如果风淋的风量不能保证无菌操作时，需考虑更换初效过滤器或高效过滤器。

(5）使用0.1％-0.5％新洁尔灭溶液或0.1％过氧乙酸水浸泡双手，擦干。也可用消毒酒精喷淋双手，还可以使用酒精棉球擦拭双手皮肤。

(6)根据需要，点燃超净工作台内的酒精灯，用于某些情形的辅助消毒或灭菌。酒精灯的用途有：①打开各类瓶盖前先过火，以固定灰尘。②打开的瓶口、试管口过火焰使可能出现的少量液滴干燥。③镊子使用前经火焰烧灼灭菌。

熟练的操作者，无菌操作时可以不使用酒精灯。

在生物安全柜内进行无菌操作时，禁止使用酒精灯，否则容易引起火灾。

(7)准备使用的吸管、滴管、试管、试剂瓶、培养瓶等无菌物品均确认灭菌包装完好无损，用消毒剂擦拭去除无菌物品外包装的粉尘后，再放人超净工作台内，但应避免一次放入过多的物品，以免影响操作。

(8)外旋盖试剂瓶、离心管开启后，盖子应按内表面朝下的方式放置于台面。也可用手指夹持瓶盖，但需保护盖子内表面不受污染。在无菌操作时，双手和非灭菌器材不得在开口的无菌器皿上方穿越。

(9)同一根移液管或滴管不应连续用于两个不同的细胞株系操作，也不可用于存在交叉污染的取液操作，注意及时更替。吸取培养液的移液管或滴管应避免接触培养瓶、培养孔或离心管的口内壁，以防止细胞株系的互相混杂污染。

(10)从灭菌筒中选取灭菌移液管或滴管后，拿取的方式应该是手背朝向吸液端，以手心方向套装胶头或电动大量移液器。

(11）洒落在培养瓶上或台上的液体，立即用酒精棉球擦净。

(12）操作完毕后，及时恢复超净工作台的工作台面各物品的摆放常态。