［实验器材］

1．仪器

倒置显微镜，CO2培养箱，普通冰箱，超净工作台，低速冷冻离心机，显微数码摄影系统，孵蛋器。

2．材料与试剂

（1）非无菌材料酒精棉球，离心管架，血细胞计数板，记号笔。

(2)无菌材料和试剂辅料镊，眼科镊，眼科手术剪，一次性培养皿，6孔细胞培养板，15ml离心管，长丝滴管，l0ml刻度移液管，0.25胰蛋白酶溶液，含500U/ml硫酸庆大霉素的Hank's液，10%BS-DMEM培养液，lmol/LHCl溶液。

(3）组织细胞材料孵化10d的鸡胚蛋。〔操作步骤〕

1．消化法培养—原代细胞培养

(1)取材取孵化10d的鸡胚蛋,75％酒精棉球擦拭蛋壳，大头朝上平稳立放于离心管架上。用辅料镊剥开顶部的部分蛋壳，换一把眼科镊挑破血囊膜，小心取出鸡胚，放于无菌培养皿内，用手术剪除去头部，然后用弯头眼科捏夹起腹部皮肤，剪开腹腔和胸前，去除内脏。

(2）漂洗和剪切将胚体用镊子夹取，用含500U/ml硫酸庆大霉素的Hank's液淋洗3遍以去除血污（含红细胞等血液细胞），转移到无菌培养皿内，用手术剪剪成1mm3的小块。

(3）消化加入无菌0.25％胰蛋白酶溶液使组织块浸没，放37℃培养箱保温1020min，期间每3-5min观察、振摇1次，使组织松散。若观察到组织块显白色时，取到超净工作台内，无菌操作用长丝滴管反复吹打组织块。添加3-5m1完全培养液，换一支长丝滴管反复吹打，将细胞悬液通过100目不锈钢筛网，收集到另一个无菌培养皿内，换另一支长丝滴管，收集细胞悬液到无菌15ml外螺旋盖离心管内。

(4)离心与计数1000r/min6min离心，无菌操作下小心倾倒去除上清。然后用弹指法使沉淀松散，添加5-10m1完全培养液，用长丝滴管小心混匀。用微量移液器取细胞悬液到计数板计数，每次2个计数窗的读数应接近，取平均值为本次读数的细胞密度，连续2次的读数相近时取均值代表该单细胞悬液的细胞密度。

(5)接种与培养用完全培养液调整细胞密度为1×105/ml，接种到6孔细胞培养板内，接种2孔。标注组织细胞名称、班级组号、接种日期等信息。静置后，在倒置显微镜下观察孔内细胞状况和形态，拍摄数码照片。放37℃5%CO2培养箱培养。

(6)观察记录和换液每天观察，针对有代表性的视场，拍摄数码照片。记录内容包括：

观察时间（培养时间）、细胞形态、贴壁情形、染菌状况、培养液颜色。在成纤维细胞形成单层以前，需要每3-4天更换一次新鲜培养液。形成细胞单层，汇合度接近90％时即终止培养，整理实验数据。

2．组织块培养—组织培养

(1)取材取孵化10d的鸡胚蛋,75％酒精棉球擦拭蛋壳，大头朝上平稳立放于离心管架上。用辅料镊剥开顶部的部分蛋壳，换一把眼科镊挑破血囊膜，小心取出鸡胚，放于无菌培养皿内，用手术剪除去头部，然后用弯头眼科捏夹起腹部皮肤，剪开腹腔和胸前，去除内脏。

(2)漂洗和剪切将胚体镊子夹取，用含500U/ml硫酸庆大霉素的Hank's液淋洗3遍以去除血污（含红细胞等血液细胞），转移到无菌培养皿内，用手术剪剪成1mm3的小块。

(3)离心1000r/min离心6min，无菌操作下小心倾倒去除上清。然后用弹指法使沉淀松散，添加5-10m1完全培养液，用长丝滴管小心混匀。
离心操作重复1次。

(4)接种与培养添加新鲜完全培养液，使组织块浸没。用长丝滴管小心取组织块悬浮液，按3-5mm间隔排布组织块液滴，置于6孔细胞培养板内，接种2孔。小心操作，使每个小液滴仅含1个组织块，可用微量移液器移除多余液体。

标注组织细胞名称、班级组号、接种日期等信息。

针对有代表性的显微视场，拍摄数码照片。放37℃5%CO2培养箱静置培养。

(5）观察记录和换液培养16-24h，每孔添加新鲜完全培养液2.5-3.0ml。逐天观察培养孔。针对有代表性的显微视场，拍摄数码照片。记录内容包括：观察时间（培养时间）、细胞形态、贴壁情形、染菌状况、培养液颜色。

在成纤维细胞形成单层以前，需要每3-4天更换一次新鲜培养液。形成细胞单层，汇合度接近90％时即终止培养，整理实验数据。

〔注意事项〕

1．自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件，细胞计数可在有菌环境中进行。

2.75％酒精泡消毒的时间不宜过长，以免酒精从口和肛门浸入鸡胚体内。

3．待到组织块周围长出单细胞层后将组织块剔除，便可收获细胞或进行传代培养。4.胰蛋白酶消化的时间长短与组织细胞的幼嫩程度、数量以及酶的活力等因素密切相关，另外在消化过程中应密切观察，及时吹打，避免消化过度。