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重组药物和单克隆抗体药物生产概况

发布时间:2015-11-26 00:00 作者:中国标准物质网 阅读量:1184

一、重组药物制备

本书所指重组药物仅限于动物细胞构建的转基因细胞株。

所谓重组药物,是指利用基因工程方法构建稳定表达特定外源基因的细胞株,通过细胞大量培养的方法,收集含该外源基因表达产物的培养上清,从而进一步分离纯化该基因产物。该基因产物便是重组药物,因此,重组药物的生产限制于细胞株的细胞总数和细胞活性。

总体而言,重组药物的范围很广,除了动物细胞株构建的重组药物以外,还包括微生物菌株构建的重组药物,常见的如E.coli工程菌株表达体系和酵母工程菌株表达体系。

重组药物生产用细胞株是利用基因工程构建的转基因细胞株,能稳定表达目标基因。

重组药物生产中的大量细胞培养技术路线主要是:细胞复苏→种子细胞扩大培养→生产罐培养→培养上清收集→重组药物分离纯化。

(一)重组人促红素(CHO细胞)
重组人促红素(CHO细胞)是注射用的一种重组药物。药典中使用的重组人促红素细胞株是构建自CHO-dhfr-细胞系,由带有人促红素基因的重组质粒转染CHO-dhfr-细胞系后筛选建立。

生产中,从WCB中复苏,接种进行种子细胞扩大培养,最后使用转瓶或细胞罐进行生产培养。培养液不含牛血清和抗生素,并且在生产中对所使用的细胞株有严格的传代限制。

(二)干扰素

干扰素分为α、β、γ3类。天然干扰素主要是由人白细胞、类淋巴细胞、成纤维细胞或T淋巴细胞诱生,经提取和纯化获得。

重组干扰素是利用人细胞来源的a干扰素基因、β干扰素基因、γ干扰素基因重组到靶细胞构建细胞株,然后大量培养该细胞株,收集培养上清用于分离纯化目标干扰素。目前主要是重组到E.coli的各种工程菌,很少报道由动物细胞构建的重组干扰素细胞株。

有报道,利用人成纤维细胞大量培养制备天然β干扰素是利用构建于人包皮细胞的FS-4和FS-35细胞株进行的,即复苏后接种进行种子细胞扩大培养,然后使用滚瓶培养或微载体培养进行生产。一般使用MEM培养基,添加2%-4%的人血浆、卡那霉素200U/ml。需要干扰素诱生剂,诱生剂包括10μg/ml环己亚胺、lμg/ml放线菌素、polyI:C(多聚肌胞)、NDV-F(新城鸡瘟病毒)。另一种是由Burkitt淋巴瘤患者所得的类淋巴细胞系,称Namalva细胞系。Namalva细胞系产生的干扰素中85%为α干扰素,15%为β干扰素。培养基用RPMI1640,添加3%小牛血清和0.75%Primatone(一种动物组织的可溶性消化物),也需要添加干扰素诱生剂,如仙台病毒、NDV-F。

利用人成纤维细胞制备天然β干扰素的细胞大量培养技术路线一般是:细胞复苏→种子细胞扩大培养→生产罐培养→诱生剂诱导培养→培养上清收集→干扰素分离纯化。

二、单克隆抗体制备

单克隆抗体制备的前提是利用杂交瘤技术构建杂交瘤细胞株,该杂交瘤细胞能稳定分泌特定的单克隆抗体。

如限于注射使用的抗人T细胞CD3鼠单抗便是一种收集于2010年版《中国药典》三部中的治疗用单克隆抗体。

药典中使用的稳定分泌鼠抗人T淋巴细胞CD3单克隆抗体的杂交瘤细胞株,是以T淋巴细胞CD3为抗原免疫小鼠,通过杂交瘤技术与小鼠骨髓瘤细胞融合后筛选建立的1个杂交瘤细胞株。

(一)体内接种法生产

从WCB中复苏杂交瘤细胞,接种进行种子细胞扩大培养,最后使用腹水接种方法进行生产培养。小鼠腹腔接种一定数量的杂交瘤细胞,待腹水瘤生长临近最大限度时,进行腹水收集和单抗分离纯化。

接种腹水使用SPF小鼠是BALB/c小鼠或BALB/c小鼠与瑞士小鼠的F1代。

(二)体外培养法生产

包括滚瓶培养、细胞罐培养和细胞工厂培养。滚瓶培养是应用比较广泛的一种,但产量低下,一般培养上清含单克隆抗体的浓度为10-60μg/ml,大量制备时成本偏高。细胞罐培养和细胞工厂培养可能是一种不依赖实验动物的大量制备方法。

杂交瘤细胞属于悬浮细胞,容易实现半连续培养或连续培养,在合适的培养控制参数下,若能有效抑制细胞凋亡,促进细胞生长,有效地维持抗体的持续合成与分泌,将可以连续收获单克隆抗体。

体外培养时,微生物污染风险比较高,杂交瘤遗传稳定性会出现变化,需要及时进行克隆化培养分离合成和分泌抗体能力低下的变异细胞,或使用传代数低的、持续稳定的分泌抗体的细胞株。

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