（一）系统适应性研究

所谓的系统适应性研究是许多分析方法的有机组成，它对分析设备、分析仪器、实验操作规程和被分析样品等组成的完整系统进行系统性评估，来确定整个分析系统的可适用性、可靠性。《美国药典》中定义系统适应性试验是用来确认仪器或系统的性能能够满足既定标准，这些测试与药品测试一起进行，以确保仪器或系统的性能在使用时是被接受的。系统适应性试验是液相和气相色谱法的重要组成部分，是用来证明色谱系统在使用时满足预期的试验要求，是对仪器性能、分析操作、色谱柱条件及被测试样品的综合评价。主要评价指标包括：分离度（Resolution,R)、系统精密度、拖尾因子（Tailingfactor,T）等，评价指标的标准通常来自方法确认的规定，所以这种系统适用性试验认为是基于实验方法的系统适用性试验，是实验方法的必要组成。

（二）分析方法验证的内容

分析方法验证就是根据检验项目的性质，预先设置一定的验证内容和验证标准要求，并通过设计合理的试验来验证所采用的分析方法是否符合检验项目的要求。

1．方法验证的一般原则

(1)对于仅需按照实验室日常测试操作步骤即可测定的检验项目不需要进行验证，如外观、密度、质量、灰分、装量、pH值等。

(2)方法验证的内容应根据检验项目的要求，结合采用的分析方法的特征来确定；

(3)同一分析方法用于不同检验项目会有不同的验证要求。

2．需要验证的检验项目

检验项目是为控制药品质量，保证药品安全有效而设定的检测项目。根据检测项目的设定目的和验证内容的不同要求，ICH将需要验证的检验项目分为四类。

(1)鉴别实验；

(2）杂质的限度检测；

(3）杂质的定量测定；

(4）含量测定，包括原料和制剂中有效成分的含量，制剂中其他成分（如防腐剂等）的含量，溶出度与释放度等检查中的溶出量，以及含量均匀度。

除此之外，还有一些物理项目的检测如测粒径分布、旋光度、熔点和硬度，根据其要求与其他检验项目有所不同，通常其分析方法验证有不同的要求。

鉴别的目的在于判定被分析物是目标化合物，而非其他物质。用于鉴别的分析方法要具有较强的专属性和耐用性。
杂质检查的主要控制杂质，分为限度控制和定量测定。用于限度检查的分析方法验证侧重专属性、检测限和耐用性。用于定量测定的分析方法验证强调专属性、准确度、精密度、线性、范围、定量限。

全面分析方法验证和部分分析方法验证应根据分析方法类型选择以下参数进行验证。

1．准确度

准确度指用该方法测定结果与真实值或参考值接近的程度。准确度为定量测定的必要条件，因此涉及定量测定的检测项目均需要验证准确度、如含量测定，杂质的定量试验等。

准确度试验浓度应能覆盖整个考虑的范围，并且应包含接近定量限的浓度点，浓度范围的中间值，还有校正曲线的最高点。对于制剂来说，以回收率试验来进行验证。试验设计需考虑在规定的范围内，制备三个不同浓度的样品，各测定三次，即测定九次，报告已知加入量的回收率（％）或测定结果平均值与真实值之差及其可信限。

(1)含量测定。原料药含量测定方法的准确度可用已知纯度的对照品或样品进行测定，或用本法所得结果与已建立准确度的另一方法测定的结果进行比较。

制剂可用含已知量被测物的各组分混合物进行测定。如不能得到制剂的全部组分，可向制剂中加入已知量的被测物进行测定。必要时，与另一个已建立准确度的方法比较结果。

(2）杂质定量试验。杂质定量测定的准确度可向原料药或制剂中加入已知量杂质进行测定。如果不能得到杂质或降解产物，可用本法测定结果与另一成熟的方法进行比较。

如不能测定杂质的相对响应因子，可在线测定杂质的相关数据，如采用二极管阵列检测器测定紫外光谱，当杂质的光谱与主成分的光谱相似，则可采用原料药的响应因子近似计算杂质含量（自身对照法）。并应明确单个杂质和杂质总量相当于主成分的重量比（％）或是面积比（％）。

2．精密度

精密度指在规定的测试条件下，同一个均匀样品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度，一般用偏差、标准偏差或相对标准偏差表示。精密度可以从重复性、中间精密度、重现性三个层次考虑。

重复性指相同操作条件下，较短时间间隔的精密度。如在实验室、实验者、实验日期、装置、器具以及实验用药品的批号等实验条件均未改变的情况下，从均匀样品中抽取数个供试品短时间内进行重复分析测定，所得到的精密度。

中间精密度指实验室内不同实验条件发生变更下测定结果的精密度。如在同一实验室内，实验者、实验日期、实验装置、实验器具以及实验用药品批号等实验条件一部分或全部改变的情况下，从均匀样品中抽取数个供试品进行重复分析测定，所得到的精密度。中间精密度验证的目的是正式方法在同一实验室内运行能够得到相同的结果。方法的中间精密度可以反映以下因素引起的结果差异。

a．不同的操作人员；

b．不一致的操作时间；

c．不同的仪器；

d．不同供应商的标准品和试剂；

e．不同批次的色谱柱；

f.综合因素。

重现性指不同实验室之间测定结果的精密度。如在不同实验室间，从均匀样品中抽取的多个供试品进行重复分析测定，所得到的精密度。重现性的目的是证实分析方法在不同实验室运行能够得到相同的结果。分析方法的重现性通过不同实验室的不同分析人员对均匀样品分析的结果计算而得。重现性的验证对于在不同实验室使用的方法非常重要。可能影响重现性的因素有房间温湿度差异、设备的特征参数不同（如HPLC系统的延迟时间不同）、色谱柱的厂家或批号不同以及操作人员的经验不同。

3．专属性

专属性指在其他成分（如杂质、降解产物、辅料等）可能存在的情况下，对被分析物进行准确可靠测定的能力。为证明专属性，需要目标成分的积极响应和对一些干扰物质响应的控制。通常，鉴别、杂质检查、含量测定方法中均应考察专属性。如采用的方法不够专属，应采用多个方法予以补充。专属性的验证可以通过比较不同性质的样品分析结果进行评价，比如某被检测物质有A、B、C三种样品，A仅含被测物样品；B含有其他成分的被测物质的样品；C为不含被测物质，仅含其他成分的样品，如果其他成分不易得到，可用含有其他成分的样品替代。那么这个被检测物质的专属性验证可以通过比较A、B、C这三个不同性质的样品分析结果进行评价。

(1)鉴别。鉴别试验应证明被分析物符合其特征，专属性试验要求证明能与可能共存的物质或结构相似的化合物区分，通常通过含被分析物的样品呈正反应，而不含被测物成分的样品呈负反应，结构相似或组分中的有关化合物也要呈负反应的途径来证明。

(2）杂质检查。作为纯度检查，所采用的分析方法应确保可检出被分析物中杂质的含量，如有关物质、重金属、残留溶剂等。因此，杂质检查要求分析方法有一定的专属性。

在可获得杂质情况下，可向供试品中加入一定量的杂质，证明杂质与共存物质能够得到分离和检出，并具有适当的准确度和精密度。再不能获得杂质或降解产物的情况下，专属性可通过与另一种已证明合理但分离或检测原理不同、或具有较强分辨能力的方法进行结果比较来确定。或将供试品用强光照射、高温、高湿、酸／碱水解以及氧化的方法进行破坏，比较破坏前后检出的杂质个数和量，必要时采用二极管阵列检测器和质谱检测器，进行色谱峰纯度检查。

(3）含量测定。含量测定的目的是得到样品中被分析物的含量或效价的准确结果。

在可获得杂质的情况下，对于主成分含量测定可在供试品中加入杂质或辅料，考察测定结果是否受干扰，并与未知杂质和辅料的试样比较测定结果。在不能获得杂质情况下，可采用另一个经验证了的或《中国药典》收载方法进行比较，对比两种方法测定的结果。也可采用破坏性试验（强光照射、高温、高湿、酸／碱水解以及氧化），得到含有杂质或降解产物的试样，用两种方法进行含量测定比较结果。必要时进行色谱峰纯度检查，证明含量测定成分的色谱峰中不包含其他成分。

4．检测限度

检测限度指样品中被测物能被检测出的最低量。检测限度以通过空白样品或检测限度附近的样品测定值的标准偏差以及检测限度附近的标准曲线的斜率计算。使用色谱法时，测定值的标准偏差可以用信噪比代替。检出限度计算公式：

DL＝3.3σ/slope

5．定量限度

定量限度指样品中被测物能被定量测定的最低量。定量限度以通过空白样品或定量限度附近的样品测定值的标准偏差以及定量限度附近的标准曲线的斜率计算。使用色谱法时，测定值的标准偏差可以用信噪比代替。定量限度计算公式：

QL＝10σ/slope

6．线性

线性指在给定范围内，检测结果与样品中被测物浓度呈正比关系的程度。线性可以直接用待测物质测定（通过稀释标准贮备液）或分别称取待测品种的各组分后合成混合物。配制5个以上不同浓度的标准溶液（浓度范围至少在期望浓度的80%-120%)，每个浓度进样不少于2次，用试验结果计算线性。响应值应与被分析物的浓度呈直接的比例关系，或通过证明定义明确的数学计算形式比例关系。用于结果计算的线性回归方程其截距不得明显偏离零点。如果得到一个明显的非零截距，应证明其对方法准确度无影响。

通常用图形化的方式来评价线性，加上一个数学等式，或仅采用等式标表示。公式通常表示为用信号高度或峰面积对被分析物浓度的函数作图。有时由于线性的偏离不易检测，可以采用两种其他的作图方式。

7．范围

范围指能达到一定精密度、准确度和线性，测试方法适用的高低限浓度或量的区间。范围应根据分析方法的具体应用和线性、准确度、精密度结果和要求确定。原料药含量测定，范围应为测试浓度的80％-120%。杂质测定，范围应根据初步实测，拟订出规定限度的士20%。如果含量测定与杂质检查同时测定，用百分归一化法，则线性范围应为杂质规定限度的土20%。

（三）分析方法验证的确认与接受

1．系统适应性研究的确认与接受

欧洲药典规定的色谱方法系统适应性研究常规指标认可标准如下。

拖尾因子：主峰的拖尾因子要求在0.8到1.5之间。

含量测定的重复性应符合表7-8要求。

分离度：相邻峰之间分离度大于1.5。

理论塔板数：根据组分、色谱柱和相对保留时间不同而不同。

检测限度应低于相关物质的忽略限度。

定量限度应等于或小于相关物质的忽略限度。

2．分析方法验证的确认与接受

分析方法验证的认可标准指用于判定分析方法是否适应检验要求的一系列指标范围。目前我国或世界发达国家官方尚未发布统一的各验证参数的认可标准指导性文件。只要能说明其合理性的指标一般都表示该方法被确认或被接受。

3．分析方法验证的确认与接受的重要性

在质量控制过程中，由于其地位的重要，分析方法的验证越来越受到重视，在我国或发达国家药品注册过程中，分析方法的验证的优劣成为评价药品质量管理体系的重要内容。企业应尽可能对其分析方法进行全面验证，并按GMP标准的要求，做好其规范化管理工作。