（一）实验目的

1．掌握滤膜法测定粪大肠菌群的原理。

2．掌握滤膜法测定粪大肠菌群的步骤。

3．了解粪大肠菌群对评价水质状况的重要性。

（二）实验原理

滤膜是一种微孔性薄膜。将水样注入已灭菌的放有滤膜（孔径0.45μm）的滤器中，经过抽滤，细菌被截留在膜上，然后将滤膜贴于M-FC培养基上，44.5℃下进行培养，计数滤膜上生长的此特性的菌落数，计算出每1L水样中含有粪大肠菌群数。

（三）培养基与试剂

1.M-FC培养基制备

M-FC培养基成分：胰胨l0g,乳糖12.5g,蛋白胨3g，酵母浸膏3g,氯化钠5g，胆盐三号1.5g,1％玫瑰色酸溶液（溶于0.2mo1/L氢氧化钠液中）l0mL,1％苯胺蓝水溶液l0mL,蒸馏水1000mL。

将培养基中除苯胺蓝和玫瑰色酸外的成分，置于蒸馏水中加热溶解，调节pH为7.4，分装于小烧瓶内，每瓶l00mL，于115℃灭菌20min。贮于冰箱中备用。临用前，按上述配方比例，用灭菌吸管分别加入已煮沸灭菌的1％苯胺蓝溶液1mL及新配制的1％玫瑰色酸溶液（溶于0.2mo1/L氢氧化钠溶液中）1mL,混合均匀。加热溶解前，加入1.2%~1.5％琼脂可制成固体培养基。如培养物中杂菌不多，则培养基中不加玫瑰色酸亦可。

在密封瓶中的脱水培养基成品要存放在大气湿度低、温度低于30℃的暗处，存放时应避免阳光直接照射，并且要避免杂菌侵入和液体蒸发。当培养液颜色变化，或体积变化明显时废弃不用。

2．试剂

所用试剂除另有注明外，均为符合国家标准的分析纯化学试剂，实验用水为新制备的去离子水。

（四）实验操作方法

1．水样量选择

水样量的选择根据细菌受检验的特征和水样中预测的细菌密度而定。如未知水样中粪大肠菌的密度，就应按表2-22所列体积过滤水样，得知水样的粪大肠杆菌密度。先估计出适合在滤膜上计数所应使用的体积，然后再取这个体积的1/10和10倍，分别过滤。理想的水样体积是一片滤膜上生长20-6。个粪大肠菌群菌落，总菌落数不得超过200个。使用的水样量可参考表2-22。

2.滤膜及滤器灭菌

将滤膜放入烧杯中，加入蒸馏水，置于沸水浴中煮沸灭菌三次，每次15min。前两次煮沸后需更换水洗涤2-3次，以除去残留溶剂。也可用121℃灭菌10min,10min一到，迅速将蒸汽放出，这样可以尽量减少滤膜上凝集的水分。滤器、接液瓶和垫圈分别用纸包好，在使用前先经121℃高压蒸汽灭菌30min。滤器灭菌也可用点燃的酒精棉球火焰灭菌。

3．过滤装置安装

把无菌操作滤器装置依照图2-17装好。

4．过滤

用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘，将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上，稳妥地固定好滤器。将适量的水样注入滤器中，加盖，开动真空泵即可抽滤除菌。

5．培养

使用M-FC培养基。培养基含或不含琼脂，不含琼脂的培养基使用已用M-FC培养基饱和的无菌吸收垫。将滤过水样的滤膜置于琼脂或吸收垫表面。将培养皿紧密盖好后，置于能准确恒温于44.5℃±0.5℃的恒温培养箱中，经24h±2h培养。

（五）结果计算

粪大肠菌群菌落在M-FC培养基上呈蓝色或蓝绿色，其他非粪大肠菌群菌落呈灰色、淡黄色或无色。正常情况下，由于温度和玫瑰酸盐试剂的选择性作用，在M-FC培养基上很少见到非粪大肠菌菌落。必要时可将可疑菌落接种于EC培养液，44.5℃±0.5℃培养24h±2h，如产气则证实为粪大肠菌群。

计数呈蓝或蓝绿色的菌落，计算出每1L水样中的粪大肠菌群数。

粪大肠菌群菌落数（个／L)=滤膜上生长的粪大肠菌群菌落群/过滤水样量（mL)×1000