因周围空气及所有培养基配方中碳酸氢钠的不同，需将孵箱设定在不同的CO2浓度。一般常用5％一10%。培养液中所用的碳酸氢钠是平衡气相中的CO2。

培养的细胞产生CO2，也需要少量CO2存活和生长。如果不补加CO2可在培养液中加用4mM(0.34g/L)碳酸氢钠，拧紧培养瓶口；用5%CO2浓度时培养液中加23.5mM(1.97g/L)碳酸氢钠；用10%CO2的话，培养液中加47mM(3.95g/L）碳酸氢钠，培养瓶口松开，便于空气平衡。