毛细管等电聚焦（capillaryisoelectricfocus,CIEF）是指在毛细管中进行的等电聚焦，由于毛细管本身的抗对流性质，CIEF可在自由溶液中进行，也可在凝胶中进行。CIEF不但具有传统等电聚焦的优点，而且也同时具有毛细管电泳的高效、快速、微量和往上检测等特点，使CIEF在蛋白质、多肽的分离分析上有很好的应用前景。毛细管等电聚焦分离方法按下面三步进行。

第一步先将脱盐的试样（蛋白质）以）≥1％的浓度与两性电解质溶液混合，用压力进样充入毛细管柱，进样端为阳极端，置于阳极电解质溶液如H3PO4中，检测端为阴极端，置于阴极电解质如NaOH中。第二步施加电压，进行电泳实验。两性电解质离子迁移时在毛细管柱中形成pH的位置梯度，而蛋白质在迁移时会在其等电点的pH区域内停止移动。这样PI不同的蛋白质各组分会在毛细管内很窄的不同pH区域内聚焦，等电聚焦实际上也是一个试样浓缩过程，这一过程可用于浓缩试样中的组分。第三步在阳、阴极电解液中加入盐或碱如NaCl或NaOH，破坏pH梯度，使各组分蛋白质重新带电，在电场力作用下发生迁移、检测，从而使不同组分的蛋白质得到分离。可见该方法实际上是按进样等电聚焦检测三步进行，具有极高的分辨率，可以分离等电点相差0.01pH的两种蛋白质。

电渗流的存在会破坏聚焦区带的稳定，因此毛细管等电聚焦时要减少电渗流。方法之一是在毛细管壁表面进行键合亲水聚合物处理，以降低管内壁的Zeta电势，经处理后的表面还能除去可能吸附蛋白质的活性点；采用在毛细管等电聚焦运行时，在介质中加添加剂，如经丙基甲基纤维素，也可达到同样目的。

等电聚焦后的区带移动，除了上述通过加盐使之作电泳迁移外，还可用流体动力学方法迁移，即使用泵或真空使区带通过检测器窗口，或使用电渗流迁移方法。