北京普天同创生物科技有限公司
不同相对分子质量的大黄多糖片段与抗溃疡性结肠炎作用有显著的相关性,呈明显的组效关系。其中相对分子质量范围在((6-8)×105的活性唐古特大黄多糖(Rheumtanguticumpolysaccharides,RTP)片段含量最高且疗效最好,是大黄多糖抗溃疡性结肠炎的主要活性成分。在活性RTP抗溃疡性结肠炎新药研发中发现,RTP的单糖组成分析是控制质量标准和提供该多糖基本信息的最重要环节。以1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)为单糖的衍生化试剂,建立毛细管区带电泳(CZE)用于中药大黄多糖(RTP)的单糖组成及其摩尔比率的测定。方法灵敏、快速、准确,可用于中药RTP的组成分析。
1.电泳条件
中性空心石英毛细管柱长度58.5cm,有效长度48.5cm,毛细管柱温度25℃,工作电压l0kV,3470Pa气压进样5s,检测波长245nm。运行缓冲液为150mmol/L的硼砂溶液(pH10.8)。样品溶液和缓冲液皆于4℃储存,在使用前用0.45μm微孔滤膜滤过,且临用前超声脱气处理。每次运行前依次用0.lmol/LNaOH溶液、去离子水、电泳缓冲液冲洗柱子2min。
2.RTP水解
准确称取RTP样品20mg于安瓶管中,加Rha内标后,分别加入2mol/LH2SO42.0mL,充氮气封管,110℃油浴水解6h。冷却至室温,用NaOH溶液中和至约pH7.0,并以H2O稀释到3mL,以2500r/min离心5min,收集上清液,得待衍生化用的多糖水解样品溶液。
3.衍生化方法
取多糖水解样品溶液100μL,置于具塞试管中,依次加入0.5mo1/L的PMP甲醇溶液和0.3mo1/LNaOH溶液各50μL,混匀后置于70℃水浴反应30min,取出室温放置l0min,再加入50μL0.3mo1/LHCl浴液中和。加入ImL三氯甲烷萃取,充分振荡、离心,弃去下层,重复3次。得到上层,然后加入500μLH2O,离心,吸取400μL,用于CZE分析。
4.测定结果
在优化电泳条件下,8种单糖衍生物实现了良好的分离,并证实RTP由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸5种单糖组成,其摩尔比为8.01:5.01:30.30:1.00-1.56,样品测定回收率为96.4%-105.3%。该方法灵敏、快速、准确,可用于中药RTP的组成分析。
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