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β-半乳糖苷酶试验

发布时间:2016-04-12 00:00 作者:中国标准物质网 阅读量:1063

(1)原理 

有的细菌可产生β-半乳糖苷酶,能分解无色的邻硝基酚-β-半乳糖苷(O-nitrophenyl-β-galactopyranoside,ONPG)生成黄色的邻-硝基酚。在很低浓度下也可检出。

细菌分解乳糖必须有半乳糖苷渗透酶(galactosidepermease)和β-半乳糖苷酶的参加。前者可将乳糖通过细胞壁送到细胞内。后者存在于细菌的细胞内.将进入菌细胞的乳糖分解为葡萄糖和半乳糖:具有上述两种酶的细菌可迅速分解乳糖。迟缓分解乳糖的细菌只有β-半乳糖苷酶,缺乏半乳糖苷渗透酶,或是其活性很弱,不能很快将乳糖运送到菌细胞内,所以通常需要几天时间乳糖才被分解。ONPG与乳糖的分子结构相似。且分子较小,不需半乳糖苷渗透酶的运送就可进入菌细胞内,由菌细胞内的β-半乳糖苷酶将其分解为半乳糖和黄色的邻价位硝基酚:采用ONPG试验,可将迟缓分解乳糖的细菌迅速取得阳性结果。

(2)培养基或试剂

①0.75mol/LONPG溶液:取80mgONPG溶于15mL蒸馏水中.再加入缓冲液(6.9gNaH2PO4溶于45mL蒸馏水中,用30%NaOH调整pH为7.0,再加水至50mL)5mL,置4℃冰箱中保存ONPG溶液应为无色,如出现黄色则不应再用。

②ONPG培养基:

(3)试验方法与结果

①将测定菌接种于TSI(或克氏双糖铁培养基)斜面上,于37℃培养18h,挑取一大环菌苔于0.25mL无菌生理盐水中制成菌悬液,加入1滴甲苯(有助于酶的释放)并充分振摇。将试管置37℃水浴5min,加入0.25mLONPG试剂,水浴20min-3h观察结果。ONPG试剂一般在20-30min内显色,菌悬液呈现黄色为阳性反应(+)。不变色为阴性(一)。

②ONPG液体法:取一环细菌纯培养物(量要大)接种在ONPG培养基上置37℃培养1-3h或24h,如有β-半乳糖苷酶,会在3h内产生黄色的邻硝基酚;如无此酶,则在21h内不变色(国家标准采用此法)。

(4)应用 

迅速及迟缓分解乳糖的细菌ONPG试验为阳性(黄色),而不发酵乳糖的细菌为阴性(不变色)。本实验主要用于迟缓发酵乳糖菌株的快速鉴定。埃希氏菌属、构椽酸杆菌属、克雷伯氏菌属、哈夫尼亚菌属、沙雷氏菌属和肠杆菌属等均为试验阳性,而沙门氏菌属、变形杆菌属和普罗威登斯菌属等为阴性。

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