1.实验材料及仪器

(1)药品 牛肉膏，蛋白胨，葡萄糖，可溶性淀粉，NaCl，KNO3，K2HPO4，MgSO4，FCSO4，琼脂。

(2）试剂 10%NaOH,10%HCl。

(3)其他 托盘天平，电炉．硫酸纸．牛皮纸，线绳，棉花，纱布，石棉网，精密pH试纸，标签，烧杯，量筒，玻棒，三角瓶，滴管，手提式灭菌锅。

2.实验步骤

培养基的种类很多，配制方法也不完全相同，但其基本程序和要求是大体相同的一般培养基的配制程序如下。

计算一称量一溶解定容一调节pH值、加琼脂并溶解一过滤一分装一加塞一包扎—灭菌一摆斜面一无菌检查。

(1）计算 一般培养基配方用百分比或加人各种物质的质量或体积表示，配制前应先估计工作中需要培养基的数量，然后按比例计算各种物质的用量。

(2)称量 用托盘天平分别称取所需各药品。有些药品用量很小，不便称量（如某些培养基中使用的微量元素成分），可先配制成较浓的溶液，然后按比例换算，再从中取出所需要的量，加入培养基中。

对牛肉膏、酵母膏等比较豁稠、不是粉状的原料，可先将玻棒和烧杯称重，再连同玻棒和烧杯一起称量原料。或者，在称量纸上称量后．连同称量纸一起投入水中，待原料溶解后将称量纸取出。

(3)溶解 先在容器内力［H人少于需要量的水；然后按配方上的顺序，依次投人各成分进行溶解。为避免生成沉淀造成营养损失，营养物质加人顺序应为先加缓冲化合物，然后是主要元素；再加入微量元素，最后加人维生素、生长因素等。最好是一种营养物溶解后再加入下一种成分。若各种成分均不会生成沉淀，可以一起加人。如有难溶物质可加热促使溶解。待全部成分完全溶解后，补足所需水量。

(4)调节pH值 先用精密pH试纸测定培养基原始pH值。然后根据配方要求以2mol/LHCl或2mol/LNaOH进行调整。此时应用滴管逐滴加人酸或碱，边搅动边用精密pH试纸测pH值，直至符合要求为止。在调节过程中，尽量不要调得过酸或过碱，以免某些营养成分可能被破坏。并防止因反复调整而影响培养基的容量。

培养基经高压灭菌后·其pH值可降低0.1-0.2，故调节pH时，应比实际需要的pH值高0.1-0.2，也有个别培养基在灭菌后pH值反而升高。

如果所培养的微生物对酸度的要求比较严格，其pH值可用酸度计测定。

(5)溶解琼脂配制 固体培养基时，需加人凝固剂琼脂。琼脂在水中溶化较慢且易沉淀于容器底部而烧焦。最好用夹层锅溶化琼脂。如果采用直接在火源上加热的方法，则应将液体培养基放在有石棉网的电炉上，待液体培养基煮沸后再加琼脂，并不断搅拌，以防琼脂沉淀，糊底烧焦。琼脂完全融化后，要加热水补足蒸发的水分。

(6)过滤 以四层纱布趁热过滤。

(7)分装 根据需要将培养基分装于三角瓶或试管内。分装量视具体情况而定通常：分装入试管中的固体培养基以管高的1/5为宜，灭菌后趁热摆斜面，斜面长度为试管高度的1/3-1/2；分装人试管中的半固体培养基，一般以管高的1/3为宜，灭菌后直立冷却．凝固后为半固体深层琼脂；分装人试管中的液体培养基．以试管高度的1/4为宜；分装人三角瓶的培养基，以不超过三角瓶容积的1/2为限。

分装过程中，应注意勿使培养基粘到管口或瓶口上，以免粘污棉塞而导致杂菌污染。

(8)加塞 培养基分装完毕后。在试管日或丁角瓶口上加上棉塞，以过滤空气防止外界杂菌污染培养基或培养物．并保证容器内培养的需氧菌能够获得无菌空气。棉塞松紧应适宜，不能过松或过紧。太松，通气好但过滤作用差，容易污染；太紧，过滤作用好但影响通气。检查松紧的方法是：将棉塞提起，试管跟着被提起而不下滑，表明棉塞不松；将棉塞拔出，可听到有轻微的声音而不明显，表明棉塞不紧。

加塞时棉塞总长度的3/5应在管口或瓶口内，管口或瓶口外面的部分不要短于1cm，以便于无菌操作时用手拔取。做棉塞的棉花应采用纤维较长的普通棉花，医用脱脂棉易吸水变湿造成污染，一般不宜采用。若需通气培养对，如用摇床振荡培养，可用所谓通气塞，即用6-8层纱布，或在两层纱布间均匀地铺一层棉花，代替棉塞，以供给菌体更多的氧气进行生长或发酵。

(9）包扎 加塞后，再在棉塞外包一层防潮纸，以避免灭菌时棉塞被冷凝水沾湿，并防止接种前培养基水分散失或污染杂菌。然后用线绳捆扎并注明培养基名称、配制日期及组别。

(10）灭菌 培养基包扎完毕后应立即按其配方规定的条件灭菌。如当天不能灭菌者应放人冰箱内保存。

(11)摆斜面 灭菌后，固体培养基如需制成斜面，应趁热将试管上部垫于1根玻棒或木条上，使培养基斜面长度为试管长度的1/2。

(12)无菌检查 将灭过菌的培养基放人37℃恒温箱内培养过夜，无菌生长为合格培养基。

(13）保存 暂不使用的无菌培养基，可在冰箱内或冷暗处保存，但不宜保存时间过久。