(1）样品的处理

①固体和半固体样品：称取1g样品加人盛有9mL的磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯或均质袋内，8000-10000r/min离心均质1-2min，或拍打1-2min，制成1：10的样品匀液。

②液体样品：以无菌吸管吸取1mL样品置盛有9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1：10的样品匀液。然后做适当的不同10倍稀释。

(2）加样

①分别用无菌移液管移取1mL液体原液或1mL10^-1稀释度的其他样品匀液至2个灭菌的平皿。若有多个稀释系列，则只接种一个平板。

②换取另一灭菌的移液管移取1mL10^-1稀释度液体样品或1mL10^-1稀释度的其他样品。若有必要，重复上述步骤进行进一步10倍系列稀释。

③若可能，仅选取适宜的连续2个10倍稀释样品液进行接种，使菌落数控制在10-300CFU/mL。

④加样后，倾注已冷却至44-47℃的平板计数琼脂12-15mL到平皿中，从最初样品悬液的配制到倾注结束不超过45min.

(3）培养待琼脂凝固后，将平板翻转，(30±1)℃培养（72±3)h

(4)菌落计数方法选择连续2个稀释度不超过300CFU的平板，且1个平板至少含15CFU进行计数，计算公式为：N=∑C/(n1+0.1n2)d（其中各字母含义与国标法中相同）：

所有平板的菌落数都不足15CFU，计算2个平板菌落的算术平均值m。

液体样品：Ne=m

固体样品：Ne=m×d^-1

无菌生长：液体样品＜1；固体样品＜1Xd^-1

最终结果保留前两位有效数字。

(5)菌落总数测定几点说明除了在国标中提到的要注意的，还需要说明的是以下几点

①由于食品中起变质作用的细菌主要为嗜冷菌和嗜温菌，所以36℃培养时．部分菌漏检，有人经实验证实，在牛乳的菌落计数培养中，30℃比36℃培养高出1个数量级因此ISO中推荐使用30℃培养。

②对于所有平板的菌落数都不足15CFU或无菌生长时菌落的计数中，固体、液体样品计算方法不一主要是因为液体可以不稀释直接加样，而固体样品必须做第一个稀释才能加样，因此无菌生长时要报告小于1X稀释因子的倒数。

③为防止细菌增殖和产生片状菌落，每个样品从开始稀释到倾注最后一个平皿所用的时间不得超过45min；皿内琼脂凝固后，不要长时间放置，可避免菌落蔓延生长。

④检样过程中应用稀释剂做空白对照，用以判定稀释液、培养基、平皿或吸管可能存在的污染。同时，检样过程中应在工作台上打开一块空白平板计数琼脂，其暴露时间应与检样时间相当，以了解检样在检验操作过程中有无受到来自空气的污染。