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生物毒性监测技术(二)

发布时间:2016-07-02 00:00 作者:中国标准物质网 阅读量:1122

一、藻类生长抑制试验

在水生生态系统及水生食物链中,藻类是水体中主要的初级生产者,在光的作用下它们吸收水中的无机营养盐类和二氧化碳,合成有机物,是水生态系统中物质循环和能量流动中的最基础环节。通过各种途径进入水体的污染物首先作用于藻类,对其产生危害,因此藻类是评价化学物质对水生生物的影响的主要环节之一。藻类对于许多毒物比鱼类、甲壳类更敏感,具有生长周期短、易于分离培养、可直接观察细胞水平上的中毒症状和可以得到化学物质对许多世代及种群水平影响等特点,是较为理想的毒性分析试验材料。

藻类生长抑制试验是在加有不同浓度毒物或废水的藻类培养液中,接种数量相等的处于指数生长期的淡水绿藻和(或)蓝藻,在藻类生长最适宜的环境条件下(如温度、光照等),定时(每隔24h)测定并记录藻类生长情况,试验周期为72h。受试物的浓度不同,会对藻类生长产生不同程度的抑制。根据各浓度组和对照组的生长情况比较,计算抑制率,求出抑制一半藻类生长的毒物浓度,即半数有效浓度(EC50),及其95%置信区间,并统计得出最低可观察效应浓度(LOEC)和(或)无可观察效应浓度(NOEC)。具体试验方法可参照国内标准GB/T21805-2008《化学品藻类生长抑制试验》、国际标准ISO8692和ISO14442。

测定不同时间藻类的生物量,以量化藻类的生长和生长抑制。由于藻类干重难以测定,多使用其他参数替代,如细胞浓度、荧光性和光密度等。但应知晓所使用的替代参数与生物量之间的换算系数。

测定终点为生长抑制。可以试验期间平均比生长率或生物量的增加来表达。从一系列试验浓度下的平均比生长率或生长量可以获得致使藻类生长率或生长量受到x%抑制(如50%)的被试物质浓度,并表达为ErCX或Eycx(如ErC50或EyC50)。

二、发光细菌的急性毒性试验

发光细菌是一类在正常的生理条件下能够发射可见荧光的细菌,因含有荧光素、荧光酶、ATP等发光要素,该类细菌在有氧条件下通过细胞内生化反应而产生微弱荧光。当细胞活性升高,处于积极分裂状态时,其ATP含量高,发光强度增强。

发光细菌法是一种利用灵敏的光电测量系统测定毒物对发光细菌发光强度影响的方法。发光细菌在毒物作用下,细胞活性下降,ATP含量水平下降,导致发光细菌的发光强度降低。研究表明,毒物浓度与发光细菌的发光强度呈线性负相关关系。毒物的毒性可以用EC50表示,即发光细菌的发光强度降低50%时毒物的浓度。因此,可以根据发光细菌的发光强度来判断毒物的毒性大小,用发光强度表征毒物所在环境的急性毒性。

发光细菌的发光机理的研究表明,不同种类发光细菌的发光机理相同,都是由特异性的荧光酶(LE)、还原态的黄素单核昔酸(FMNH2)、八碳以上长链脂肪醛(RCHO)、氧分子(02)所参与的复杂反应,大致历程如下式所示:

FMNH2+LE→FMNH2·LE+02→LE·FMNH2·02+RCH→LE·FMNH2·02·RCHO→LE+FMN+H2O+RCOOH+光
有毒物质主要通过两个途径来抑制细菌发光,其一为直接抑制参与发光反应的酶活性,其二为抑制细胞内与发光反应有关的代谢过程。凡能够干扰或破坏发光细菌呼吸、生长、新陈代谢等生理过程的任何有毒物质都可以根据发光强度的变化来测定,主要的敏感毒物为有机污染物和重金属类。

发光细菌法因其简便、快速、灵敏且成本较低而日益受到关注,并于1998年列入德国国家标准(DIN38412)和国际标准(ISO11348),我国也于1995年将其列为水质急性毒性检测的标准方法(GB/T15441-1995《水质急性毒性的测定一发光菌法》)。该方法采用海水发光细菌—明亮发光杆(PhotobacteriumphosphoreumT3),即费氏弧菌(VibriofischeriT3)进行检测。但是,发光细菌法具有发光强度本底值差异较大、检测期间发光变化幅度宽的问题,且由于该菌需要2%的NaCl维持其正常发光生理状态,对物质毒性会造成一定程度的干扰。1985年,我国学者分离得到一种兼性厌氧的淡水型发光菌—青海弧菌(Vibrioqinghaiensissp.nov.),其典型菌株为Q67。该菌生长时对环境NaCl浓度要求低,pH耐受范围广,且检测金属毒物与海洋发光菌相比具有较高的灵敏度,因此越来越多地受到重视。该方法可参照《水和废水监测分析方法(第四版)》。

三、种子发芽和根伸长的毒性试验

种子的萌发和生根对于植物具有重要意义,该过程是一个非常活跃的植物胚胎生长发育过程,更是一个多种酶参与的生理生化变化过程。当种子暴露于污染物或有害环境中时,发芽和根伸长常受到抑制,表现为发芽率低、根长短。

种子发芽和根伸长的毒性试验即根据上述特点,将种子放在含一定浓度受试物的基质中,使其萌发。当对照组种子发芽率达65%以上,根长(即从胚轴和根之间的转换点到根尖末端)达20mm时,结束试验,并测定种子的发芽率和根伸长抑制率。最终评价受试物对植物胚胎发育的影响。具体试验方法可参照《水和废水监测分析方法(第四版)》和我国环境保护行业标准HJ/T153-2004《化学品测试导则》299种子发芽和根伸长毒性试验。

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