一、实验原理

1．铬的营养及生理作用

1797年，法国化学家Vaupuel首先发现了铬元素，英文名称为Chromium。起初人们认为是有毒的元素，但随着研究的深入，人们发现铬是生物体必需的微量营养元素。

铬在动物营养中的研究及应用起步较晚，始于1992年，但发展较快。许多学者在铬的研究方面做了大量的工作，有关铬的代谢及生物学功能的机制都得到初步阐明。以此为基础，营养学家们对铬在人和动物营养方面的意义进行了深入的探讨，取得了可喜的成就。

铬生物活性的发挥是靠三价铬，铬主要以Cr³⁺的形式构成葡萄糖耐量因子（GTF) 。 Moora-than等实验证明GTF，的作用机制是促进胰岛素结合到靶细胞的特异性受体上，从而影响糖类、脂类、蛋白质和核酸的代谢。一些证据表明，铬在血清胆固醇的体内平衡中起作用。Abraham和Mertz分别报道了给动物喂以高胆固醇日粮的同时，补铬可以使动脉胆固醇降低，动脉斑块面积明显缩小。几项对于人和动物的研究表明，补铬能降低血清三酰甘油和总胆固醇含量。铬有促进氨基酸进入细胞从而促进蛋白质合成的能力，采食蛋白质不足的大鼠对把某些氨基酸组合到心脏的能力降低，使用胰岛素可使组合作用稍有改善，而补铬则可以使其作用显著加强。铬也与维持核酸结构的完整性有关。Hermian和Speck证明铬与核酸之间有相互作用，他们报道将组织用铬酸盐和重铬酸盐处理后，大大地减少了用三氯醋酸可能提高的核酸量。更有实验观察到高核酸的部分，铬含量也高；铬与核酸之间连接很强；铬也能保护RNA免受热引起的变性作用。研究表明，铬首先结合到染色体的DNA上，使启动点增加，从而促进肝中核糖核酸（RNA）的合成。铬具有改变免疫作用的能力，包括对疫苗的反应。高铬的摄入可以防止皮脂醇（皮脂醇是一种最重要的糖皮脂激素，它可以抑制细胞分裂素和抗体的产生，并妨碍它们发挥作用，同时抑制淋巴细胞的功能和白细胞增殖）的免疫抑制反应，从而激发机体的免疫功能，进而促进机体的生长。

2．铬的缺失及补充

正常人体内只含有6一7 mg的铬，且分布很广。微量的铬对人体很重要，也很敏感。据报道，每kg的体重只要给予ug级的铬就足以显示其生物功能。然而，尽管铬的需要量如此少，但缺铬的间题仍然存在，这主要是由于饮食倾向于更多的精细加工食品，而在精细加工的过程中丧失了大量的铬，从而减少了铬的摄入量；另一方面，这些精制食品还促进体内贮藏铬的大量排泄。因此，伴随人体摄取低铬饮食可能使得存在的问题更加恶化。

人们发现，人类缺铬是一个慢性的过程。人体缺铬会产生葡萄糖、脂肪、蛋白质代谢障碍，引起各种疾病，如动脉粥样硬化、糖尿病、冠心病、末梢神经炎、近视眼等，尤其婴儿缺铬易患消瘦性蛋白质营养不良症；铬对心肌损伤有明显的保护作用；铬在胰岛素活性中的作用对缺血的心肌是有益的。

动物缺铬表现为胆固醇或血糖升高、生长迟缓、免疫力缺乏、繁殖能力下降和寿命缩短等，如禽类喂含铬量低于5ug·kg-1的饲料日粮时，羽毛大量脱落；用低铬日粮喂兔，则母兔产崽率下降；用无铬日粮喂种牛，精液量大大减少，精子畸形率显著提高，当补铬后，症状消失。

铬进入人体，经肠道吸收，在血液里与运输铁的球蛋白结合，而后被运至肝脏及全身。由于不同形式的铬在组织中的结合程度不同，导致吸收率不同，因此铬的吸收与化学结合形式有很大的关系。

在研究铬的补充时主要有无机铬（常用的CrC1₃·6H₂0、Cr₂(SO₄)₃、Cr(NO₃)₃和有机铬（常用烟酸铬、蛋白鳌合铬、铬酵母）两种形式。饲料中的总铬含量不能完全反映可利用铬或铬的营养状况。无机铬不但毒性大，且以吸收水平极低，质量分数为0.4％一3%。无机铬制剂显效缓慢，低剂量数月内才显现效果，高剂量（2-10 mg·d^-1）数周内显效，且疗效与剂量无直线关系。有机铬疗效远较无机铬好，剂量与效应呈直线关系。有机铬吸收迅速且安全，吸收率可达10％一25%，是铬的活性形式。由于部分人体及生物体内不能把无机铬转化成有机铬的形式，所以最好是补充有生物活性的有机铬，以改善缺铬状况，从而减少缺铬的危险性。Kegley等的研究表明，把铬以4 x 10^-4g·L^-1水平加入牛的日粮中，结果对植物凝血素（PHA）皮下注射8h后的外周淋巴母细胞形成性应答反应最大的是高铬酵母和CrNic。说明有机态的铬能增加机体的免疫反应。而无机态的氯化铬就没有这一生物活性。瑞士联邦学院Gebert和Wenkin的研究表明，饲料中添加氯化铬、烟酸铬和铬酵母均能提高日增重、饲料利用率和背最长肌面积，但烟酸铬和铬酵母的效果明显好于氯化铬，尤其以铬酵母的效果最佳。

综上所述，补铬用无机铬制剂的效果不如应用有机铬制剂的效果明显，并且有一定的毒副作用。而有机铬中，烟酸铬大多是以化学合成方法制得，分离纯品极为困难，成本较高，因而限制了其生产和应用；铬酵母则是以微生物发酵方法为制备手段，具有生物活性高、毒性小的特点，并且不需对铬酵母中有机铬进行分离纯化，生产成本较低，可以认为是一种有较好前景的有机铬补充物。

3．富铬酵母的制备

铬酵母是在培养基中添加无机铬化合物（CrC1₃·6H₂0、Cr₂(S0₄)₃、Cr(NO₃)₃等），利用活酵母菌的生物同化作用，使无机铬转化为有机铬而得到的一种类似天然产物的有机铬产品。

酵母菌（yeast）是一个不具分类学意义的普通名称，通常是用于以芽殖或裂殖来进行无性繁殖的单细胞真菌，以与霉菌区分开。极少数种可产生子囊抱子进行有性繁殖。酵母菌中有很多常用的菌株，如啤酒酵母（S. cerevisiae Hansen，主要用于酿造白酒和啤酒等）、葡萄汁酵母(S.uvanim Beijerinck，常用于果酒厂和啤酒厂等）、德巴利酵母（Debaryo myces lodder et Kreger-van Ki，该酵母产柠檬酸能利用烷烃作碳源）、汉氏德巴利酵母（Hansenula H.et P.Sydow，是酒精工业的有害菌）、毕赤氏酵母（Pichia Hansenula，能利用石油或农副产品及工业废料产生菌体蛋白）、栗酒裂殖酵母（S.Pombe Lindner)、白色球拟酵母（T.Candide(Satio) Lodder)、球形球拟酵母（T. globosa(olson et Hammer) LodderetKreger van Rij）等。不同的酵母菌有着不同的最佳培养条件。其中用来进行富铬酵母制备的一般为啤酒酵母。啤酒酵母中也有很多不同的菌株，具有不同的特性。

微生物需要的营养物质主要包括碳素化合物、氮素化合物、水分、无机盐类和生长素等。这些物质的主要功用有三方面：供给微生物合成原生质和代谢产物的来源；产生微生物在合成反应及生命活动中所需的能量；调节新陈代谢。

环境对微生物的影响作用可分为：适宜环境，能促进微生物的生长发育；不适宜环境，使微生物的生长延缓、停止甚至死亡。温度对微生物生长的影响具体表现在：①影响酶活性，从而影响酶促反应速率，最终影响细胞物质合成；②影响脂膜的流动性，影响营养物质的吸收与代谢产物的分泌；③影响物质的溶解度。pH值通过影响细胞脂膜的透性、膜结构的稳定性和物质的溶解性或电离性来影响营养物质的吸收，从而影响微生物的生长率。

酵母生长最适的pH值是4.5一5.5，最低2一3，最高7一8。所以酵母的培养应保持培养基的酸性。通常微生物的发酵过程中，培养基的酸度均有不同程度的增加，所以进行培养前应调整pH在5.0左右为宜。

铬酵母的制备过程中，培养基中投铬浓度、接种量也是影响酵母菌生长及最后发酵产物获得的主要因素。铬是一种重金属元素，当培养基中浓度太大时，不利于酵母的生长，而浓度太低时，发酵产物的收率较低。一定量的培养基中接种量过多，营养物质相对表现不足，发酵一段时间后，代谢物可能带来不利于微生物的生长的环境因素，从而影响发酵产物的获得，所以接种量也是利用微生物发酵法制备产品的关键影响因素。

4．富铬酵母中铬含量的测定

铬元素的分析方法有很多种，如分光光度法、原子吸收法、发射光谱法、速差动力法、X-射线吸收法、高效液相色谱法、ICP - MS法等。在这些方法中，分光光度法、原子吸收法操作比较简单，适用于富铬酵母中铬元素的分析测定。

(1)富铬酵母分析的前处理

在铬酵母的分析之前应将酵母干粉进行消化处理。目前的消化处理大都是通过强酸和强氧化剂混合酸搭配来进行的，也可用微波消化来处理样品。生物样品中的重金属分析与其他重金属分析一样，关键在于如何将重金属从其他可干扰其测定的物质中分离出来。一般是用湿法灰化或干法灰化的手段将生物样品中的有机物质破坏除去。至于湿法或干法的选择，要以不致丢失所要分析的对象为原则。破坏有机物质后，样品中的重金属留在湿法灰化的消化液中或干法灰化的残渣中，然后根据待测物质在样品中的大概含量和客观条件，选择分析方法。

(2)分光光度法显色剂的选择

铬的常见价态是+3价或+6价，利用Cr(Ⅵ）的强氧化性及催化活性，可使某些有机试剂褪色或颜色加深而用于定量测定铬。以氧化还原反应为基础的常用试剂有苯基荧光酮类试剂、偶氮类试剂、三苯甲烷类试剂、二安替比林甲烷类试剂等。因为此类氧化还原反应大多在强酸性介质中进行，故增大了体系的干扰限量，提高了方法的选择性。此类反应体系线性范围宽，表现摩尔吸光系数一般在104数量级，适于多种样品的分析，有较好的使用价值。但从应用的角度考虑，由于这些显色剂市场上很难得到，而且有些显色剂要求的反应条件又很苛刻，

如绝大部分偶氮类试剂需要在加热条件下才能与Cr(Ⅲ）显色，有些甚至得煮沸数十分钟，所以限制了其在铬酵母中铬分析领域的应用。

三苯甲烷类试剂是测定铬的灵敏试剂，常用的有铬天青S(CAS),溴邻苯三酚红（BPR）等，在表面活性剂或碱性染料存在下，表现摩尔吸光系数可达10⁶数量级，但试剂的选择性较差。用于某些复杂基体实样分析时，常需要借助适当的分离富集手段以消除干扰，这就给铬的分析带来了不必要的麻烦。实验步骤的增多，势必会带来较大的误差，尽管这一类方法表现为摩尔吸光系数值很高，但由实验步骤带来的误差消除也是很难的，而且对于铬酵母这种复杂体系的测定更是困难，所以其在铬酵母中铬分析的应用上也较少。

使用对氨基二乙基苯胺测定铬的报道也较多。此法是用氧化还原反应来显色的，表观摩尔吸光系数为3.3 x 10⁴L· mol^-1·cm^-1，其最佳pH值为3.1一5.5，这就需要应用缓冲溶液来控制酸度，而且在应用缓冲溶液前将较高的酸度用碱液调节到缓冲范围内。这样就引入了大量的杂离子，对于酵母干粉试样来说，消解液的酸度很高，调节pH值需要大量的碱液，此又会带来大量的杂离子。杂离子的引入对于铬酵母这样含微量铬的体系是不适用的。

二苯碳酰二肼(DPC）是一种能被Cr(VI)氧化的显色剂，在酸性的条件下它首先被氧化成苯肼羧基偶氮苯，Cr( VI）被还原成Cr( Ⅲ )。苯肼羧基偶氮苯能与Cr(Ⅲ）形成紫红色化合物，反应简式可表示为

此反应的物质的量比是3:2(Cr(VI):DPC)，生成的紫红色化合物在540 nm波长下有最大吸收，反应的摩尔吸光系数为4 x 10⁴。方法的最小检出量是0.2 ug。但该方法在显色酸度低时，显色慢。

综上所述，对于铬酵母中铬的测定，选用方法应根据实验方法的精确程度和方便适用性来定。相对于其他方法，吸光光度法是一种较方便实用的方法。比较以上介绍的分光光度方法，二苯碳酰二肼(DPC）法是比较好的测定铬酵母中铬的方法。因为这种方法在酸度较高的条件下就能显色，减少了样品消化后调节酸度的步骤，避免引入过多杂离子。而且这种方法的稳定性及灵敏度和线性范围都适合铬酵母中铬的测试，其他方法或不具有该方法的优点，或实现起来比较困难。

(3)分光光度法测定富铬酵母中的铬含量

将消化好的消化液转移至比色管中，加入显色剂，定容至25.00 ml，显色10 min左右，溶液变成紫红色，即得空白用没加样品的消化液。用722型分光光度计于540 nm下测其吸光度。分别取0.0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 ug的铬元素以相同条件进行消化，然后测其吸光度（吸光度测试条件同上），然后绘制标准曲线。根据标准曲线得出待测样中总铬的含量。

(4)原子吸收法测定富铬酵母中的铬含量

将消化好的消化液转移到10.00 ml的容量瓶中，用质量分数5.0%HNO3溶液定容。

分别测含不同浓度Cr(VI）的标准系列的吸光光度值，作标准曲线。根据实验测得的吸光度值，即可求出待测样品中铬的含量。

二、主要仪器和药品

高压灭菌器、无菌操作箱、恒温空气振荡培养箱、恒温干燥箱、高速离心机、粉碎机、分光光度计、玛瑙研钵、分析天平、锥形瓶、烧杯、移液管、离心管、比色管。

麦芽汁、柠檬酸、啤酒酵母（或面包酵母）、三氯化铬、无水乙醇、硝酸、高氯酸、显色剂（二苯碳酰二肼）。

三、实验内容

1．富铬酵母的制备

将250ml麦芽汁分装到培养锥形瓶中，加入CrC1₃·6H₂0溶液，调节培养基pH=5.0，封口，在121℃下灭菌20 min，待培养基冷却后，在无菌工作台上将啤酒酵母菌接种到培养瓶中。完成接种后，将培养瓶转移到恒温摇床上，选择震荡的转速为200 r·min^-1，在28℃下，培养48 h便得到新鲜的富铬酵母。再经离心、水洗、干燥、研磨，即制得富铬酵母干粉。

2．富铬酵母中铬含量的测定

取0.2一0.5 g富铬酵母干粉样品于消化瓶中，加入8 ml左右的HC10₄-HN0₃（体积比为4:1)混合液，将消化瓶置于电炉上消化。当溶液变为无色时即可停止消化。将消化液进行定容。采用分光光度法或原子吸收法进行测定。根据标准曲线即可得出待测样品中的铬含量。