食品中溶血性链球菌检验

链球菌属（Streptococcus）是一个古老的属，根据溶血性，可把链球菌分为以下三种。

(1）甲型溶血性链球菌（a-Hemolytic streptococcus）菌落周围有1-2mm宽的草绿溶血环，称甲型溶血或a溶血。亦称草绿色链球菌（Streptococcus viridans)，为条件致病菌。

(2）乙型溶血性链球菌(β-Hemolytic streptococcus）菌落周围形成一个2-4mm宽，界限分明、完全透明的溶血环，完全溶血，称乙型溶血或β溶血，又称溶血性链球菌(Streptoccus hemolyticus )。该菌致病力强，引起多种疾病。包括A群链球菌(Streptococcus pyogenes）和B群链球菌（Streptococcus agalactiae)。

(3)丙型链球菌（γ-Streptococcus）不产生溶血素，菌落周围无溶血环，故又称不溶血性链球菌（Streptococcusnon-hemolytics)。一般不致病。

用兰氏血清学分类法可将其分为从A, B, C, D, E, F, G, H, K, L, M, N, O,P, Q, R, S, T,U,V共20个血清群。1974年以后，又从中分出了肠球菌属、乳球菌属和游走球菌属，因此原来的链球菌属分成了几个属。

链球菌在自然界分布广泛，是食物污染的重要原因。文献报道，许多由食物引起的脓毒性咽喉痛和猩红热，是由A群链球菌引起，近年来，由链球菌引起的食物中毒已逐渐为人们所注意。链球菌性食物中毒，经常由乳、肉类食品所引起，多为a溶血，β型溶血型链球菌引起食物中毒较少。溶血性链球菌（Streptococcus hemolyticus）可引起皮肤化脓性感染、乳房炎、败血症等多种疾病，可通过多种途径污染乳、乳制品和肉类制品，并大量增殖而引起食物中毒。

一基础知识

1、生物学特性

形态与染色链球菌呈球形或椭圆形，直径0.6-1.O um，呈链状排列，长短不一，从4-8个至20-30个菌细胞组成不等，链的长短与细菌的种类及生长环境有关。在液体培养基中易呈长链，固体培养基中常呈短链，由于链球菌能产生脱链酶，所以正常情况下链球菌的链不能无限制延长。多数菌株在血清肉汤中培养2-4h易形成透明质酸的荚膜，继续培养后消失。该菌不形成芽孢，无鞭毛，易被普通的碱性染料着色，革兰氏阳性，老龄培养或被中性粒细胞吞噬后，转为革兰氏阴性。

培养特征需氧或兼性厌氧菌，营养要求较高，普通培养基上生长不良，需补充血清、血液、腹水，大多数菌株需维生素B2、维生素B6、烟酸等生长因子。在20-42℃能生长，最适生长温度为37℃，最适pH为7.4-7.6。在血清肉汤中易成长链，管底呈絮状或颗粒状沉淀生长。在血平板上形成灰白色、半透明或不透明、表面光滑、边缘整齐、直径0.5-0.75mm的细小菌落，不同菌株溶血不一。

生化反应分解葡萄糖，产酸不产气，对乳糖、甘露醇、水杨苷、山梨醇、棉籽糖、蕈糖、七叶苷的分解能力因不同菌株而异。一般不分解菊糖，不被胆汁溶解，触酶阴性。

抗原结构链球菌的抗原构造较复杂，主要有以下三种。

(1）核蛋白抗原或称P抗原，无特异性，各种链球菌均相同。与葡萄球菌有交叉，不能用于分类。

(2）多糖抗原或称C抗原，系群特异性抗原，是细胞壁的多糖组分，据此可将链球菌分为20个血清群。对人致病的90％属于A群，其次为B群。可用稀盐酸等提取。

(3）蛋白质抗原或称表面抗原，具有型特异性，位于C抗原外层，其中可分为M,T,R,S四种不同性质的抗原成分，与致病性有关的是M抗原，基于M蛋白抗原性的不同，可将A群链球菌区分为100多个不同的血清型。

毒素主要有以下几种。

(1）链球菌溶血素溶血素有O和S两种，O为含有一SH的蛋白质，具有抗原性，S为小分子多肽，分子量较小，故无抗原性。

(2)致热外毒素曾称红疹毒素或猩红热毒素，是人类猩红热的主要毒性物质，会引起局部或全身红疹、发热、疼痛、恶心、呕吐、周身不适。

(3）透明质酸酶又称扩散因子，能分解细胞间质的透明质酸，故能增加细菌的侵袭力，使病菌易在组织中扩散。

(4）链激酶又称链球菌纤维蛋白溶酶，能使血液中纤维蛋白酶原变成纤维蛋白酶，具有增强细菌在组织中的扩散作用，该酶耐热，100℃ 50min仍可保持活性。

(5）链道酶又称链球菌DNA酶，能使脓液稀薄，促进病菌扩散。

(6）杀白细胞素能使白细胞失去动力，变成球形，最后膨胀破裂。

抵抗力该菌抵抗力一般不强，60℃ 30min即被杀死，对常用消毒剂敏感，在干燥尘埃中生存数月。乙型链球菌对青霉素、红霉素、氯霉素、四环素、磺胺均敏感。青霉素是链球菌感染的首选药物，很少有耐药性。

2、流行病学

溶血性链球菌常可引起皮肤、皮下组织的化脓性炎症、呼吸道感染、流行性咽炎的爆发流行以及新生儿败血症、细菌性心内膜炎、猩红热和风湿热、肾小球肾炎等变态反应。溶血性链球菌的致病性与其产生的毒素及其侵袭性酶有关。

溶血性链球菌在自然界中分布较广，存在于水、空气、尘埃、粪便及健康人和动物的口腔、鼻腔、咽喉中，可通过直接接触、空气飞沫传播或通过皮肤、黏膜伤口感染，被污染的食品如乳、肉、蛋及其制品也会对人类进行感染。上呼吸道感染患者、人畜化脓性感染部位常成为食品污染的污染源。一般来说，溶血性链球菌常通过以下途径污染食品。

①食品加工或销售人员口腔、鼻腔、手、面部有化脓性炎症时造成食品的污染。

②食品在加工前就已带菌、奶牛患化脓性乳腺炎或畜禽局部化脓时，其乳和肉尸某些部位污染。

③熟食制品因包装不善而使食品受到污染。

二、国家标准检验方法

参照GB 4789. 11-2014《食品安全国家标准食品微生物学检验β型溶血性链球菌检验》。

1、检验程序

溶血性链球菌检验程序见图4-24.

2.操作步骤

(1)样品处理及增菌按无菌操作称取检样25g（或25mL)，加入盛有225mL mTSB的均质袋中，用拍击式均质器均质1一2min；或加入盛有225mL mTSB的均质杯中，以8000-10000r/min均质1-2min。若样品为液态，振荡均匀即可。(36±1)℃培养18-24h。

(2）分离将增菌液划线接种于哥伦比亚CNA血琼脂平板，(36±1)℃厌氧培养18-24h，观察菌落形态。

溶血性链球菌在哥伦比亚CNA血琼脂平板上的典型菌落形态为直径2-3mm，灰白色、半透明、光滑、表面突起、圆形、边缘整齐，并产生β型溶血。

(3）鉴定

①分纯培养：挑取5个可疑菌落（小于5个则全选）分别接种哥伦比亚血琼脂平板和接种TSB增菌液，(36士1)℃培养18-24h。

②革兰氏染色镜检：挑取可疑菌落染色镜检。R型溶血性链球菌为革兰氏染色阳性，球形或卵圆形，常排列成短链状。

③触酶试验：挑取可疑菌落于洁净的载玻片上，滴加适量3％过氧化氢溶液，立即产生气泡者为阳性。β型溶血性链球菌触酶为阴性。

④链激酶试验：吸取草酸钾血浆 0.2mL于0.8mL灭菌生理盐水中混匀，再加入经(36±1)℃培养18-24h的可疑菌的TSB培养液0.5mL及0.25%氯化钙溶液0.25mL，振荡摇匀，置于（(36±1)℃水浴中10min，血浆混合物自行凝固（凝固程度至试管倒置，内容物不流动）。继续（(36±1)℃培养24h，凝固块重新完全溶解为阳性，不溶解为阴性。R型溶血性链球菌为阳性。

⑤可选择使用生化鉴定试剂盒或生化鉴定卡对可疑菌落进行鉴定。

(4）结果与报告综合以上试验结果，报告每25g（每25mL)检样中检出或未检出β型溶血性链球菌。