食品中蜡样芽孢杆菌检验

一、基础知识

1.1生物学特性

(1）形态特征芽孢杆菌属是一大群需氧的革兰氏阳性杆菌，菌体杆状，大小为（0-1.3)um×(3-5)um；有一个或数菌体为球状，不形成丝状体，形成内生孢子。以侧生鞭毛或周生鞭毛运动，或不运动。兼性需氧能形成不突出菌体的芽孢。菌体两端较平整，多数呈链状排列，与炭疽杆菌相似。周生鞭毛，能运动，无荚膜。

(2）培养特性蜡样芽孢杆菌生长温度为25.37℃，最适生长温度30-32℃ , 10℃以下停止繁殖。在肉汤培养基中生长，浑浊，有菌膜或壁环，振摇易乳化。在普通琼脂上生成的菌落较大，直径3-10mm，灰白色、不透明，表面粗糙似毛玻璃状或熔蜡状，边缘常呈扩展状；偶有产生黄绿色色素，在血琼脂平板上呈草绿色溶血；在甘露醇卵黄多黏菌素(MYP)平板上，呈伊红粉色菌落。

蜡杆芽孢杆菌耐热性较强，其37℃ 16h的肉汤培养物的D80℃值（在80℃时使细菌数减少90％所需的时间）为10-15min; 50℃时不生长。其繁殖体不耐热，在100℃下加热20min可破坏这类菌。游离芽孢能耐受100℃ 30min，而千热120℃经60min才能杀死。

(3）生化反应特性在葡萄糖肉汤中厌氧培养产酸，从阿拉伯糖、甘露醇、木糖不产酸，分解糖类不产气。大多数菌株还原硝酸盐，50℃时不生长。

1.2致病性

蜡样芽孢杆菌引起食物中毒是由于该菌产生肠毒素。它产生两种性质不同的代谢物，包括腹泻毒素（DT）与呕吐毒素（VT）两种。DT是该菌在对数生长期合成并释放的胞外毒素，为多组分蛋白质，分子质量为38-40kDa，对热不稳定，45℃处理30min或56℃处理5 min就可以导致其失活，对链霉蛋白酶与胰酶敏感，但pH小于4或大于11时不稳定，抗原性较强可以产生特异性抗体，主要导致腹泻、腹痛，但不发热。由多组分蛋白质构成；而VT被认为是某些菌株在芽孢形成时产生的小分子多肽，分子质量一般小于5kDa，热稳定性好，120℃处理90min仍很稳定，且对胃酶与胰酶有抗尸性，在pH 2-11范围内稳定，无抗原性，主要症状为恶心、呕吐、偶有腹痛，也不发热。蜡样芽孢杆菌除了产生上述两种肠毒素外，还产生溶血素等细菌毒素。

呕吐型的潜伏期为0.5-6h；中毒症状以恶心、呕吐为主，偶尔有腹痉挛或腹泻等症状，病程不超过24h。腹泻型的潜伏期为6-15h，症状以水泻、腹痉挛、腹痛为主，有时会有恶心等症状，病程约24h。

蜡样芽孢杆菌广泛存在于尘埃、土壤、空气、水体、动植物体表，以及各种暴露于空气中的肉制品、乳制品、水果、干果、乳粉、奶油、生菜、炒米饭以及各种甜点等中，而且由于该菌能产生耐热的芽孢，所以当食物被该菌污染而又加热不足时容易导致该菌繁殖，并产生细菌毒素，从而引起摄食者中毒。引起蜡状芽孢杆菌食物中毒的食品大多数无腐败变质现象，除米饭有时微黏、入口不爽或稍带异味外，大多数食品感官正常。

二、常用检验培养基及检测原理

常用蜡样芽孢杆菌的选择分离培养基为甘露醇卵黄多黏菌素琼脂培养基（MYP）,MYP中蛋白胨和牛肉膏粉提供氮源、维生素和生长因子；D-甘露醇为可发酵糖类；氯化钠维持均衡的渗透压；琼脂是培养基的凝固剂；酚红为pH指示剂；卵黄含有卵磷脂，蜡样芽孢杆菌产生卵磷脂酶，在菌落周围产生沉淀环；并不发酵D-甘露醇产酸使菌落显红色；多黏菌素B可抑制杂菌的生长。

三、国家标准蜡样芽孢杆菌检测方法

GB 4789. 14-2014《食品安全国家标准食品微生物学检验蜡样芽孢杆菌检验》（第一法）—平板计数法。

3.1检验程序

蜡样芽孢杆菌的检验程序如图4-36所示。

3.2操作步骤

(1)样品的制备取待检样品，用无菌剪刀将样品剪碎，称取样品25g，放入盛有225mL无菌磷酸盐缓冲稀释液（或无菌生理盐水）无菌均质杯中，用旋转刀片式均质仪以18000 - 20000r/min均质12min，或拍击式均质器拍击1-2min。若样品为液态，吸取25mL样品至盛有225mL PBS或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠）中，振荡混匀，作为1：10的样品匀液。取1：10稀释液1mL加到含有9mL无菌磷酸盐缓冲液（或无菌生理盐水）的稀释瓶中，充分混匀制成1: 100的稀释液。据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头，一般情况稀释到10-6。

(2）样品接种根据对样品污染状况的估计，选择2-3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），以0.3mL, 0.3mL, 0.4mL接种量分别移入三块MYP琼脂平板，然后用无菌L棒涂布整个平板，注意不要触及平板边缘。使用前，如MYP琼脂平板表面有水珠，可放在25-50℃的培养箱里干燥，直到平板表面的水珠消失。

(3）分离、培养在通常情况下，涂布后，将平板静置10min。如样液不易吸收，可将平板放在培养箱30℃±1℃培养1h，等样品匀液吸收后翻转平皿，倒置于培养箱，30℃±1℃培养24h±2h。如果菌落不典型，可继续培养24h±2h再观察。在MYP琼脂平板上，典型菌落为微粉红色（表示不发酵甘露醇），周围有白色至粉红色沉淀环（表示产卵磷脂酶）。

从符合计数要求每个平板中挑取至少5个典型菌落（小于5个全选），分别划线接种于营养琼脂平板做纯培养，30℃±1℃培养24h±2h，进行确证实验。在营养琼脂平板上，典型菌落为灰白色，偶有黄绿色，不透明，表面粗糙似毛玻璃状或熔蜡状，边缘常呈扩展状，直径为4-10mm。

(4)确定鉴定

①染色镜检：挑取纯培养的单个菌落，革兰氏染色镜检。蜡样芽孢杆菌为革兰氏阳性芽孢杆菌，大小为(l-1.3)um×(3-5)um，芽孢呈椭圆形，位于菌体中央或偏端，不膨大于菌体，菌体两端较平整，多呈短链或长链状排列。

②生化鉴定：挑取纯培养的单个菌落，进行过氧化氢酶试验、动力试验、硝酸盐还原试验、酪蛋白分解试验、溶菌酶耐性试验、VP试验、葡萄糖利用（厌氧）试验、根状生长试验、溶血试验、蛋白质毒素结晶试验。蜡样芽孢杆菌生化特征与其他芽孢杆菌的区别见表4-23。

注：“+”表示90 %-100％的菌株阳性；“一”表示90 %-100％的菌株阴性；“十／一”表示大多数的菌株阳性；
“一／＋”表示大多数的菌株阴性。

a．动力试验：用接种针挑取培养物穿刺接种于动力培养基中，30℃培养24h。有动力的蜡样芽孢杆菌应沿穿刺线呈扩散生长，而覃状芽孢杆菌常呈“绒毛状”生长。也可用悬滴法检查。

b．溶血试验：挑取培养物接种于胰酪胨大豆羊血琼脂平板上，30℃±1℃培养24h±2h。蜡样芽孢杆菌菌落为浅灰色，不透明，似白色毛玻璃状，有草绿色溶血环或完全溶血环。苏云金芽孢杆菌和覃状芽孢杆菌呈现弱的溶血现象，而多数炭疽芽孢杆菌为不溶血，巨大芽孢杆菌为不溶血。

c．根状生长试验：挑取单个可疑菌落按间隔2-3cm距离划平行直线于经室温干燥1-2d的营养琼脂平板上，30℃±10C培养24-48h，不能超过72h。用蜡样芽孢杆菌和覃状芽孢杆菌标准株作为对照进行同步试验。覃状芽孢杆菌呈根状生长的特征。蜡样芽孢杆菌菌株呈粗糙山谷状生长的特征。

d．溶菌酶耐性试验：用接种环取纯菌悬液一环，接种于溶菌酶肉汤中，36℃±1℃培养24h。蜡样芽孢杆菌在本培养基（含0.001％溶菌酶）中能生长。如出现阴性反应，应继续培养24h。巨大芽孢杆菌不生长。

e．蛋白质毒素结晶试验：取经30℃培养24h并于室温放置3-4d的营养琼脂培养物少许于载玻片上，滴加蒸馏水混涂成薄膜。以自然干燥，微火固定后，于涂膜加甲醇半分钟后倾掉，再通过火焰干燥，于载片上滴满0.5％碱性复红液，放火焰上加热微见蒸气（勿使染液沸腾）后持续1-2min，移去火焰，使载片放置0.5min再倾去染液。用洁净自来水彻底清洗、晾干、镜检。观察有无游离芽孢和染成黑色的菱形毒素结晶体。如发现游离芽孢形成的不丰富，应将培养物置室温2-3d再行检查。苏云金芽孢杆菌用此法检测为阳性，而蜡样芽孢杆菌群的其他菌种则为阴性。

实验结果符合蜡样芽孢杆菌群的形态特征，动力试验阳性，溶血试验阳性，不能形成根状生长和不产生蛋白结晶毒素，可报告为蜡样芽孢杆菌阳性。

③生化分型（选做项目）：根据对柠檬酸盐利用、硝酸盐还原、淀粉水解、VP试验反应、明胶液化试验，将蜡样芽孢杆菌分成不同生化型别，见表4-24。

注：＋表示90%-100％的菌株阳性；一表示90％一100％的菌株阴性。

(5）结果计算典型菌落计数、确认和计算公式参照本章4.6.3.1金黄色葡萄球菌的Baird-Parker平板计数（第二法），其中A表示某一稀释度蜡样芽孢杆菌典型菌落的总数；B, B1 ,B2表示鉴定结果为蜡样芽孢杆菌的菌落数；C,C1,C2表示用于蜡样芽孢杆菌鉴定的菌落数。

(6)结果与报告根据MYP平板上蜡样芽孢杆菌的典型菌落数，按公式计算、报告每克（每毫升）样品中蜡样芽孢杆菌菌数，以CFU/g (CFU/mL）表示；如T值为0，则以小于1乘以最低稀释倍数报告。必要时报告蜡样芽孢杆菌生化分型结果。

四、FDA/BAM蜡样芽孢杆菌检测

蜡样芽孢杆菌检验程序如图4-37所示。

蜡样芽孢杆菌的分离物应符合下述条件：革兰氏阳性产芽孢大杆菌，其芽孢不突出体外；在MYP琼脂上产生卵磷脂酶而不发酵甘露醇；厌氧培养生长，发酵葡萄糖产酸；还原硝酸盐；VP阳性；分解L-酪氨酸；在含0.001％溶菌酶的培养基中能生长。要鉴别典型蜡样芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌群的其他种还需进一步进行动力试验、根状生长试验、溶菌活性试验、蛋白质毒素结晶试验。蜡样芽孢杆菌具有动力、强溶血、不形成根状菌落或不产生蛋白质毒素结晶。