食品中肉毒梭状芽孢杆菌检验

肉毒梭状芽孢杆菌简称肉毒梭菌，是一种腐生菌，可引起食物中毒，但与其他食物中毒不同，并非细菌感染，属单纯性毒素中毒，胃肠症状很少见。肉毒梭菌在自然界广泛存在，常常污染、滋生于腊肠、火腿、鱼及鱼制品和罐头等食品。肉毒中毒一年四季均可发生发病主要与饮食习惯有着密切关系。在美国以罐头发生中毒较多，日本以鱼制品较多，在我国主要以发酵食品为主，如臭豆腐、豆瓣酱、面酱、豆豉等日常家庭法制作的发酵食品；未经加热处理而直接食用的食品中，往往滋生肉毒梭菌或含有肉毒毒素（密封性保存的食品），故其肉毒梭菌的检测至为重要。

一、基础知识

1.1生物学特性

形态与染色肉毒梭菌属于厌氧性梭状芽孢杆菌属，严格厌氧、多形态细菌，约为41um×lum的大杆菌，两侧平行，两端钝圆，直杆状或稍弯曲，形成芽孢，芽孢比繁殖体宽，为卵圆形，位于次极端，或偶有位于中央，常见很多游离芽孢；芽孢有时形成长丝状或链状，有时能见到舟形、带把柄的柠檬形、蛇样线状、染色较深的球茎状，这些属于退化型。当菌体开始形成芽孢时，常常伴随着自溶现象，可见到阴影形；具有4-8根周毛性鞭毛，运动迟缓；没有荚膜；新鲜培养基的革兰氏染色为阳性。

培养特性肉毒梭菌发育最适温度为25-35℃，培养基的最适的酸碱度为pH 6.0.-8.2。在固体培养基表面上，形成不正圆形，大约3mm左右的菌落。菌落半透明，表面呈颗粒状，边缘不整齐，界线不明显，向外扩散，呈绒毛网状，常常扩散成菌苔。在血平板上，出现与菌落几乎等大或者较大的溶血环。能产生脂酶，在乳糖卵黄牛乳平板上，菌落下培养基为乳浊，菌落表面及周围形成彩虹薄层，不分解乳糖；分解蛋白的菌株，菌落周围出现透明环。

生化特性肉毒梭菌的生化性状很不规律，即使同性，也常见到株间的差异（表4-26)。

注：＋阳性反应；一阴性反应；（±）视菌株而异；（＋）多为阳性反应；（一）多为阴性反应。

1.2致病性

肉毒毒素通常是一条分子质量大约为150kDa的单一的肤链蛋白质，在内源性蛋白酶或外源性蛋白酶（如胰酶）的作用下，可以形成毒性提高的双链结构BT。根据血清型的不同，BT可以分为A, B, c, D, E,F,G型共7种，C又可以分为C1和C2两个亚型。肉毒梭菌在自然界的分布上具有某种区域性差异，显示出生态上的差别倾向。7种血清型均可以引起人类中毒，其中A,B,E是可引起人类中毒的主要血清型，而C, D两种血清型多引起禽、畜等动物的中毒。E型菌及其芽孢适应于深水的低温，在海洋地区的广泛分布，存在于海洋的沉积物、水产品的肠道内。在我国报道的肉毒梭菌食物中毒事件多由A型毒素导致，B, E型次之，F型少见。

肉毒毒素与典型的外毒素不同，并非由生活的细菌释放，而是在细菌细胞内产生无毒的前体毒素，等待细菌死亡自溶后游离出来，经肠道中的胰蛋白酶或细菌产生的蛋白酶激活后方始具有毒性，且能抵抗胃酸和消化酶的破坏，可在胃液24h不被破坏，可被胃吸收。但肉毒毒素不耐热，煮沸1 min即可被破坏。

肉毒毒素是目前已知的化学毒物和生物毒物中毒性最强的一种，毒性比氰化钾强1万倍，对人的致死量推测为10mg/kg体重。它主要侵犯中枢神经系统，通过阻断乙酰胆碱的释放而导致死亡，一旦中毒难以康复，病死率高临床表现主要表现为某些部位的肌肉麻痹，重者可死于呼吸困难与衰竭；还可以引起婴儿肉毒病，1岁以下婴儿肠道内缺乏拮抗肉毒梭菌的正常菌群，可因食用被肉毒梭菌芽孢污染的食品后，芽孢在盲肠部位定居，繁殖后产生毒素，引起中毒。

由于肉毒梭菌属于厌氧菌，所以肉毒毒素较多出现在不杀菌或杀菌不彻底的密闭包装食品中。在我国，BT引起中毒的食品主要是由家庭自制的豆瓣酱、豆酱、豆豉、臭豆腐等发酵食品，以及少数不新鲜的肉、蛋、鱼类食品；在日本，以鱼制品引起中毒者较多；在美国，以家庭自制罐头和肉、乳制品引起中毒者为多；在欧洲，多见于腊肠、火腿和保藏的肉类。

肉毒毒素是目前已知的化学毒物和生物毒物中毒性最强的一种，对人的致死量推测为l0mg/kg体重。它是一种神经毒，主要侵犯中枢神经系统，通过阻断乙酰胆碱的释放而导致死亡，一旦中毒难以康复，病死率高。

二、国家标准检验方法

参照GB/T 4789. 12-2003《食品卫生微生物学检验肉毒梭菌及肉毒毒素检验》。

2.1检验程序

肉毒梭菌及肉毒毒素检验程序如图4-41。

报告（一）为检样含有某型肉毒毒素；报告（二）为检样含有某型肉毒梭菌；

报告（三）为由检样分离的菌株为含有某型肉毒梭菌

三、检验步骤

3.1肉毒毒素检测

肉毒中毒的诊断，重要的是毒素的检出及定型；罐头食品的细菌学检验，有时需要证实肉毒梭菌的存在，不过，最终还是要根据产毒试验来鉴定细菌及其型别。

液状检样可直接离心，固体或半固体检样须加适量（例如等量、1倍量或5倍量、10倍量）明胶磷酸盐缓冲液，浸泡、研碎，然后离心，取上清液进行检测。

另取一部分上清液，调pH 6.2，每9份加10%胰酶（活力1：250）水溶液1份，混匀，不断经常轻轻搅动，37℃作用60min，进行检测。肉毒毒素检测以小白鼠腹腔注射法为标准方法。

(1)检出试验取上述离心上清液及其胰酶激活处理液分别注射小白鼠3只，每只0.5mL，观察4d。注射液中若有肉毒毒素存在，小白鼠一般多在注射后24h内发病、死亡。主要症状为竖毛、四肢瘫软、呼吸困难、呼吸呈风箱式，腰部凹陷，宛如蜂腰，最终死于呼吸麻痹。如遇小鼠猝死以致症状不明显时，则可将注射液做适当稀释，重新试验。

(2）确证试验不论上清液或其胰酶激活处理液，凡能致小鼠发病、死亡者，取样分成3份进行试验。1份加等量多型混合肉毒抗毒诊断血清，混匀，37℃作用30min; 1份加等量明胶磷酸盐缓冲液，混匀，煮沸10min; 1份加等量明胶磷酸盐缓冲液，混匀即可，不做其他处理。3份混合液分别注射小白鼠各2只，每只0.5mL，观察4d，若注射加诊断血清与煮沸加热的2份混合液的小白鼠均获保护存活，而唯有注射未经其他处理的混合液的小白鼠以特有症状死亡，则可判定检样中有肉毒毒素存在，必要时进行毒力测定及定型试验。

(3)毒力测定取已判定含有肉毒毒素的检样离心上清液，用明胶磷酸盐缓冲液做成50倍、500倍及5000倍的稀释液，分别注射小白鼠各2只，每只0.5mL，观察4d。根据动物死亡情况，计算检样中所含肉毒毒素的大体毒力（MLD/mL或MLD/g)。例如，5倍、50倍及500倍稀释致动物全部死亡，而注射5000倍稀释液的动物全部存活，则可大体判定检样上清液所含毒素的毒力为1000-10000MLD/mL.

(4）定型试验按毒力测定结果，用明胶磷酸盐缓冲液将检样上清液稀释至所含毒素的毒力大体在10-1000MLD/mL的范围，分别与各单型肉毒抗毒诊断血清等量混匀，37℃作用30min，各注射小白鼠2只，每只0.5mL，观察4d。同时以明胶磷酸盐缓冲液代替诊断血清，与稀释毒素液等量混合作为对照。能保护动物免于发病、死亡的诊断血清型即为检样
所含肉毒毒素的型别。

食物中发现毒素，表明未经充分的加热处理，可能引起肉毒中毒。检出肉毒梭菌，但未检出肉毒毒素，不能证明此食物会引起肉毒中毒。肉毒中毒的诊断必须以检出食物中的肉毒毒素为准。

3.2肉毒梭菌检出（增菌产毒培养试验）

取疱肉培养基3支，煮沸10-15min做如下处理：第1支急速冷却，接种检样均质液1一2mL；第2支冷却至60℃，接种检样，继续于60℃保温10min后急速冷却；第3支接种检样，继续煮沸加热l0min后急速冷却。

以上接种物于30℃培养5d，若无生长，可再培养10d。培养到期，若有生长，取培养液离心，以其上清液进行毒素检测试验，阳性结果证明检样中有肉毒梭菌存在。

3.3分离培养

选取经毒素检测试验证实含有肉毒梭菌的前述增菌产毒培养物（必要时可重复1次适宜的加热处理）接种卵黄琼脂平板，35℃厌氧培养48h。肉毒梭菌在卵黄琼脂平板上生长时，菌落及周围培养基表面覆盖特有的彩虹样（或珍珠层样）薄层，但G型菌无此现象。

根据菌落形态及菌体形态挑取可疑菌落，接种疱肉培养基，于30℃培养5d，进行毒素检测及培养特性检查确证试验。
培养特征检查，接种卵黄琼脂平板，分成2份，分别在35℃的需氧和厌氧条件下培养48h，观察生长情况及菌落形态。肉毒梭菌只有在厌氧条件下才能在卵黄琼脂平板上生长并形成具有上述特征的菌落，而在需氧条件下则不生长。

3.4结果报告

根据毒素检测、生化鉴定实验报告肉毒梭菌的污染情况。

①食物中发现毒素，表明未经充分的加热处理，可能引起肉毒中毒。

②检出肉毒梭菌，但未检出肉毒毒素，不能证明此食物会引起肉毒中毒。

③肉毒中毒的诊断必须以检出食物中的肉毒毒素为准。

四、试验注意事项

①典型的肉毒中毒，小白鼠会在4-6h死亡，而且98%-99％的小白鼠会在12h内死亡，因此，试验前24h内的观察是非常重要的。

② 24h后的死亡是可疑的，除非有典型的症状出现。

③如果小白鼠注射经1:2或1:5倍数稀释的样品后死亡，但注射更高稀释度的样品后未死亡，这也是非常可疑的现象，一般为非特异性死亡。

④小白鼠要用不会抹去的颜料加以标记。

⑤小白鼠的饲料与水必须及时添加、充分供应。