北京普天同创生物科技有限公司

  • CNAS实验室认可证书
  • 标准物质定级证书
  • 豫南检测资质认定证书
  • 质量管理体系认证证书
  • 农产品资质证书
  • 伟业计量高企认证证书
  • 中国计量测试学会合作单位
新闻
  • 产品
  • 仪器
  • 新闻
  • 帖子
  • 课堂

在线客服

食品微生物快速检验

发布时间:2016-08-19 00:00 作者:中国标准物质网 阅读量:745

食品微生物快速检验

一、基于免疫学的检验方法

免疫学检测即是根据抗原抗体反应的原理,利用已知的抗原检测未知的抗体或利用已知的抗体检测未知的抗原。由于抗体与抗原的结合具有特异性和专一性的特点,这种检测可以定性、定位和定量地检测某一特异的蛋白(抗原或抗体)。免疫学检测技术是近几年发展起来的新技术,现已有三大类几百余种方法,广泛地应用于各个领域中。可用于疾病诊断(传染病、自身免疫病、肿瘤病、过敏反应),食品中微生物及其毒素、药残、农残、激素和过敏原的检测。现已一些研究者把放射免疫和免疫酶技术用于食品农药残留检测,并取得极大成功。现已有多种快速检测方法,如酶免疫方法、夹心ELISA、免疫荧光法、免疫扩散和免疫磁珠等用于食物及环境中的沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌等致病菌的检测。免疫学技术以其快速、敏感、特异性强、稳定性好等优点,在食品微生物检测方面凸显了优势。国内外已经有很多公司生产了基于免疫学的食品安全检测仪器,如法国生物梅里埃的Mini-VIDAS是一种用于食物传播致病菌检测的全球领先的自动化系统,可测试大肠埃希氏菌0157(包括大肠埃希氏菌H7)、沙门氏菌李斯特氏菌单核细胞增生李斯特氏菌金黄色葡萄球菌肠毒素以及弯曲菌的检测。近年来,抗原的定量检测技术也不断推陈出新,在夹心法ELISA的基础上,开发了多抗原检测试剂盒,能同时检测微量液相样本中多个抗原含量。这项技术的应用大大缩短了诊断的时间,提高检验的准确性。

免疫学检测技术主要有常规免疫学技术、免疫标记技术和免疫细胞功能测定技术三大类,常规免疫学技术即血清学反应,下面就免疫标记技术在食品微生物检验中的应用做介绍。

1.1免疫标记技术概述

免疫标记技术是目前应用最广泛的一类免疫学检测技术,在检测的特异性、敏感性和快速性,以及对抗原、抗体的定量、定性、定位检测方面较经典的血清学反应都有了提高。免疫标记技术是将已知抗体或抗原标记上易显示的物质,通过检测标记物来反映抗原抗体反应的情况,从而间接地测出被检抗原或抗体的存在与否或量的多少。常用的标记物有荧光素、酶、放射性核素及胶体金等。免疫标记技术具有快速、定性或定量甚至定位的特点,特别是随着方法的不断改进,尤其是采用基因工程方法制备包被抗原,采用针对某一抗原表位的单克隆抗体进行阻断ELISA试验,都大大提高了ELISA的特异性,加之电脑化程度极高的ELISA检测仪的使用,使ELISA成为最广泛应用的检测方法之一。

1.2酶联免疫反应

2. 1酶联免疫反应简介

1971年瑞典学者Engvail和Perlmannn,荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法,称为酶联免疫吸附试验。其基本原理与放射免疫技术相同。酶联免疫吸附试验是一种固相免疫测定技术,其先将抗体或抗原包被到某种固相载体表面,并保持其免疫活性。测定时,将待检样本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应,后加入酶标抗体与免疫复合物结合,用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离的未结合成分,最后加入酶反应底物,根据底物被酶催化产生的颜色及其吸光度(A)值的大小进行定性或定量分析的方法。
最初发展的免疫酶测定方法。是使酶与抗体或抗原结合,用以检查组织中相应的抗原或抗体的存在。后来发展为将抗原或抗体吸附于固相载体,在载体上进行免疫酶染色,底物显色后用肉眼或分光光度计判定结果。常见用于标记的酶有辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)等。由于酶联免疫法无需特殊的仪器,检测简单,因此被广泛应用于疾病检测。这种技术就是目前应用最广的酶联免疫吸附试验,俗称ELISA (enzyme linked immunosor-bent assay)。

众所周知,酶是一种有机催化剂,很少量的酶即可导致大量的催化过程,所以极为敏感。免疫酶技术就是将抗原和抗体的免疫反应和酶的催化反应相结合而建立的一种新技术。酶与抗体或抗原结合后,既不改变抗体或抗原的免疫学反应的特异性,也不影响酶本身的酶学活性,即在相应而合适的作用底物参与下,使基质水解而呈色,或使供氢体由无色的还原型变为有色的氧化型。这种有色产物可用肉眼、光学显微镜和相电子显微镜观察,也可以用分光光度计加以测定。呈色反应显示了酶的存在,从而证明发生了相应的免疫反应。所以,这是一种特异而敏感的技术,可以在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位,或在微克甚至纳克水平上对其进行定量。

2.2用于标记的酶

用于标记抗体或抗抗体的酶必须具有下列特性:有高度的活性和敏感性;在室温下稳定;反应产物易于显现;能商品化生产。目前应用较多的有辣根过氧化物酶碱性磷酸酶葡萄糖氧化酶等,其中以辣根过氧化物酶应用最广。

2.3酶联免疫吸附试验方法

根据检测目的和操作步骤不同,有间接法、双抗体夹心法、竞争法三种类型的常用方法。

(1)间接法此法是测定抗体最常用的方法。将已知抗原吸附于固相载体,加入待检标本(含相应抗体)与之结合。洗涤后,加入酶标抗球蛋白抗体(酶标抗抗体)和底物进行测定。

操作步骤:①包被固相载体:用已知抗原包被固相载体;4℃过夜,洗涤3次、抛干;②加待检标本:经过温育(37℃/2h),使相应抗体与固相抗原结合。洗涤,除去无关的物质;③加酶标抗抗体:再次温育(37℃ /2h)与固相载体上抗原抗体复合物结合;洗涤,除去未结合的酶标抗抗体;④加底物显色:37℃ 30min,终止反应后,用酶标仪测光密度值定量测定。

(2)双抗体夹心法此法常用于测定抗原,将已知抗体吸附于固相载体,加入待检标本(含相应抗原)与之结合。温育后洗涤,加入酶标抗体和底物进行测定。

操作步骤:①用已知特异性抗体包被固相载体;②加待检标本,经过温育使相应抗原与固相抗体结合;洗涤,除去无关的物质;③加酶标特异性抗体,与已结合在固相抗体上的抗原反应;洗涤,除去未结合的酶标抗体;④加底物显色,终止反应后,用酶标仪测量光密度值进行定量测定。它是采用酶标抗抗体检查多种大分子抗原,它不仅不必标记每一种抗体,还可提高试验的敏感性。但不能用于测定半抗原等小分子物质。

(3)竞争法竞争法主要用于测定小分子抗原及半抗原,其原理类似于放射免疫测定。以测定抗原为例,将特异性抗体吸附于固相载体,4℃过夜,洗涤3次、抛干;加入待检抗原及一定量的酶标抗原(对照孔仅加酶标抗原)使二者竞争与固相抗体结合;经过洗涤分离加底物显色,终止反应后,用ELISA检测仪测定OD值。被结合的酶标抗原的量由酶催化底物反应产生有色产物的量来确定,如果待检溶液中抗原越多,被结合的标记抗原的量就越少,有色产物就减少,这样根据有色产物的变化就可求出未知抗原的量。

2.4ELISA的操作要点

优质的试剂、良好的仪器和正确的操作是保证ELISA检测结果准确可靠的必要条件。国外试剂均与特殊仪器配合应用,两者均有详细的使用说明,严格遵照规定操作,必能得出准确的结果。

(1)试剂的准备按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。自配的缓冲液应用pH计测量较正。从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用。试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。

(2)加样加在ELISA板孔的底部,避免加在孔壁上部,并注意不可溅出,不可产生气泡。加标本一般用微量加样器,按规定的量加入板孔中。每次加标本应更换吸嘴,以免发生交叉污染。

(3)保温在ELISA中一般有两次抗原抗体反应,即加标本和加酶结合物后。抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间。抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。加入板孔中的标本,其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会,只有最贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一个逐步平衡的过程。在其后加入的酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如此,所以ELISA反应总是需要一定时间的温育。温育常采用的温度有43℃ , 37℃、室温和4 ℃等。37℃是实验室中常用的保温温度,也是大多数抗原抗体结合的合适温度。实验表明,两次抗原抗体反应一般在37℃经1-2h,产物的生成可达顶峰。为加速反应,有些试验在43℃进行,但不宜采用更高的温度。抗原抗体反应4℃更为彻底,在放射免疫测定中多使反应在冰箱中过夜,以形成最多的沉淀。但因所需时间太长,在ELISA中一般不予采用。保温的方式除有的ELISA仪器附有特制的电热块外,一般均采用水浴。为避免蒸发,板上应加盖,也用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔,此时可让反应板漂浮在水面上。若用保温箱,ELISA板应放在湿盒内,湿盒要选用传热性良好的材料如金属等,在盒底垫湿的纱布,最后将ELISA板放在湿纱布上。无论是水浴还是湿盒温育,反应板均不宜叠放,以保证各板的温度都能迅速平衡。

(4)洗涤ELSIA就是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质,以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的,而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰质洗涤下来。洗涤的方式除某些ELISA仪器配有自动洗涤仪外,手工操作有浸泡式和流水冲洗式两种。洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液,洗涤液中的非离子型洗涤剂一般是吐温20。非离子型洗涤剂既含疏水基团,也含亲水基团,其疏水基团与蛋白质的疏水基团借疏水键结合,从而削弱蛋白质与固相载体的结合,使蛋白质回复到水溶液状态,从而脱离固相载体。

(5)显色和比色

①显色:显色是ELISA中的最后一步温育反应,此时酶催化无色的底物生成有色的产物。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。

②比色。

(6)结果判断

①定性测定:定性测定的结果判断分别用“阳性”、“阴性”表示。

②定量测定:在定量测定中,每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线。

应用酶联免疫技术制造的Mini-VIDAS全自动免疫分析仪,是用荧光分析技术通过固相吸附器,用已知抗体来捕捉目标生物体,然后以带荧光的酶联抗体再次结合,经充分冲洗,通过激发光源检测,即能自动读出发光的阳性标本,其优点是检测灵敏度高、速度快,可以在48h的时间内快速鉴定沙门氏菌大肠埃希氏菌0157:H7、单核细胞增生李斯特氏菌、空肠弯曲杆菌和葡萄球菌肠毒素等。

二、其他免疫学检验方法

1.1免疫荧光法

免疫荧光技术是利用荧光素标记的抗体(或抗原)检测组织、细胞或血清中的相应抗原(或抗体)的方法。用荧光素标记的抗体(抗原)与组织或细胞中的相应抗原(抗体)结合,借助于荧光显微镜或流式细胞仪对抗原(抗体)进行鉴定或定位。常用的荧光素有异硫氰酸荧光素(FITC)和藻红蛋白(PE)等,在激发光的作用下可产生发射光(即荧光)。由于荧光抗体具有安全、灵敏的特点,因此已广泛应用在免疫荧光检测和流式细胞计数领域。近年来,随着荧光素和荧光检测技术的不断进步,荧光检测的灵敏度已经接近同位素检测的水平。荧光检测技术的发展,使得免疫荧光技术在传染病诊断上有广泛的用途,如细菌、病毒、螺旋体感染的疾病等。

1.2放射免疫技术

放射免疫检测技术是目前灵敏度最高的检测技术,利用放射性同位素标记抗原(或抗体),通过竞争结合的原理使标本中待检抗原与标记抗原竞争结合有限的抗体,测定结合相中的放射性强度,可推测标本中待检抗原含量。放射性同位素具有皮克级的灵敏度,且利用反复曝光的方法可对痕量物质进行定量检测。但放射性同位素对人体的损伤也限制了该方法的使用。随着各种非同位素免疫标记技术的出现和完善,有些检测项目将取代放射免疫技术。但它毕竟是定量分析方法的先进技术。随着科学技术的进步,放射免疫分析技术将会得到更加广泛深入的发展。

1.3免疫胶体金技术

免疫胶体金技术(immune colloidal gold technique)是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。胶体金是由氯金酸(HAUC14)在还原剂如白磷、抗坏血酸枸橼酸钠鞣酸等作用下,聚合成为特定大小的金颗粒,并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态,称为胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷,可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合,由于这种结合是静电结合,所以不影响蛋白质的生物特性。胶体金除了与蛋白质结合以外,还可以与许多其他生物大分子结合,如SPA, PHA, ConA等。该方法是将二抗标记上胶体金颗粒,利用抗原抗体间的特异性反应,最终将胶体金标记的二抗吸附于渗滤膜上,实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。包括快速免疫金渗滤法(immuogold filtration assay, IGFA)即穿流式(flow through)的固相膜免疫测定和免疫层析法(immunochromatogra-hy, ICA)两种。ICA是继IGFA之后发展起来的另一种固相膜免疫测定,与IGFA利用微局限性膜的过滤性能不同,免疫色谱法中滴加在膜一端的样品溶液受膜的毛细管作用(基于色谱作用的横流)向另一端移动。移动过程中被分析物与固定在膜上某一区域的受体(抗原或者抗体)结合而被固相化,无关物质则越过该区域而被分离,然后通过标记物显色来判定试验结果,以胶体金为标记物的实验称为胶体金免疫色谱试验。

免疫胶体金技术检测方法简单而快速;不需仪器设备,操作人员不需特殊训练;试剂稳定,适用于单份测定,可以快速检测多种致病菌。胶体金免疫层析法能快速、灵敏检测金黄色葡萄球菌和沙门氏菌,无需特殊仪器设备,适合现场检测之用。

1.4免疫磁珠法技术(MACS)

免疫磁珠法是20世纪80年代出现的技术方法。这一方法的核心是在磁珠表面包被具免疫反应性的抗体进行抗原抗体反应,在细胞表面形成玫瑰花结,这些结合了磁珠的细胞一旦置于强大的磁场下,就会与其他未被结合的细胞分群,具超强顺磁场的磁珠脱离磁场后立即消失磁性,这样就可以筛选或去除所标记的细胞,从而达到阳性或阴性选择细胞的目的。这一技术目前已经广泛运用于细胞及分子生物学,分离基因、靶细胞及造血干细胞等。其分离效果得到了免疫荧光、PCR, FISH及FACS等方法的确认。应用免疫磁珠技术可以检测多种致病菌。如常见的食源性致病菌有沙门氏菌大肠埃希氏菌0157: H7、志贺氏菌副溶血性弧菌等。

1.5免疫检测技术试剂盒

近年来,抗原的定量检测技术也不断推陈出新,在夹心法ELISA的基础上,开发了多抗原检测试剂盒,能同时检测微量液相样本中多个抗原含量。这项技术的应用大大缩短了诊断的时间,提高检验的准确性。目前ELISA(酶联免疫吸附试验、酶联免疫试剂盒)方法已被广泛应用于多种细菌和病毒等疾病的诊断。蛋白免疫印迹检测试剂盒包含酶标记的具有亲和性的纯化抗体来检测小鼠、兔或者血清样本。通过特定单抗和血清样本的筛选,相应蛋白会结合到膜上。与碱性磷酸酶相偶联的酶标二抗直接作用于此部位。此试剂盒可用于致病菌的检测。免疫磁珠分离检测试剂盒,磁珠上的抗体和特异性抗原物质结合后形成抗原一抗体一磁珠免疫复合物,这种复合物在磁场作用下发生移动,达到分离特异性抗原的目的。该试剂盒可用于致病菌的分离。国内外使用的比较多的Reveal该试剂盒利用侧流式免疫色谱分析技术,有Reveal?大肠埃希氏菌0157: H7检测系统、Reveal?沙门氏菌检测系统、Reveal?李斯特氏菌检测试剂盒等。

1.6免疫检测技术的应用

免疫学检测技术是近几年发展起来的新技术,现已广泛地应用于各个领域中。一些研究者把放射免疫和免疫酶技术用于食品农药残留检测,并取得极大成功。现已有多种快速检测方法,如酶免疫方法、夹心ELISA、免疫荧光法、免疫扩散和免疫磁珠等用于食物及环境中的沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌等致病菌的检测。免疫学技术以其快速、敏感、特异性强、稳定性好等优点,在食品微生物检测方面凸显了优势。国内外已经有很多公司生产了基于免疫学的食品安全检测仪器,如法国生物梅里埃的min-VIDAS是一种用于食物传播致病菌检测的全球领先的自动化系统,可测试大肠埃希氏菌0157(包括大肠埃希氏菌H7)、沙门氏菌、李斯特氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌肠毒素以及弯曲菌的检测。

点赞图片
评论

登录后才可以评论

立即登录
分享到微信
关闭
普天同创
请告知您的电话号码,我们将立即回电

通话对您免费,请放心接听

温馨提示:

1.手机直接输入,座机前请加区号 如18601949136,010-58103629

2.我们将根据您提供的电话号码,立即回电,请注意接听

3.因为您是被叫方,通话对您免费,请放心接听