微生物自动化仪器检测

一、Mini-VIDAS微生物自动酶标检测仪

1.1检测原理、特点

Mini-VIDAS是法国生物梅里埃公司生产的一种全自动免疫荧光酶标仪，在微生物检测中主要是利用酶联免疫的原理对微生物或毒素等进行筛选检测。增菌肉汤中的抗原与试剂条中的抗体相结合，用荧光分析技术通过固相吸附器，用已知抗体来捕捉目标生物体，然后以带荧光的酶联抗体再次结合，经充分冲洗，通过激发光源检测，即能自动读出发光的阳性标本，可快速鉴定沙门氏菌、大肠埃希氏菌0157: H7、单核李斯特氏菌、空肠弯曲杆菌和葡萄球菌肠毒素等。细菌、蛋白的检测是应用一种夹心的技术，包被针上有抗体包被，所测得的荧光与标本中抗原的含量成正比。Mini-VIDAS设两个相互独立工作的检测仓，可同时进行12个相同或不同的测试。致病菌筛选定（<48h)，每天可进行60-80项测试。

1.2Mini-VIDAS大肠埃希氏菌0157 ( ECO）筛选举例

煮沸过的增菌肉汤加入试条孔后，在特定时间内，样本在SPR内、外反复循环。样本中的0157抗原与包被在SPR内部的0157抗体结合，未结合的其他成分通过洗涤步骤清除。标记有碱性磷酸酶的抗体也在SPR内、外循环并与固定在SPR壁上的大肠埃希氏菌0157抗原结合，经洗涤仍结合在SPR壁上的酶将催化底物转变成具有荧光的产物4-甲基伞形酮。在VIDAS中由光扫描器在450nm处检测该荧光强度，试验完成后由计算机自动分析结果，得出检测值。

(1）说明SRP在生产时以抗大肠埃希氏菌0157多克隆抗体包被。每-SPR上均标有“ECO”。从包装袋中取出SPR后要及时封闭包装袋。试剂条包含10个以箔封的孔，并覆以标签，标签上有条形码，显示测试种类，试剂盒批号、有效期等。第一孔加入样本，最后一孔是荧光测定用比色杯。中间各孔含有实验用各种试剂。VIDAS ECO试剂盒存于2-8℃。打开试剂盒后，SPR包装袋应密封完好，无破损，否则请不要使用SPR。取出密封袋内所需SPR，其余SPR应封好包装，并放回2-8℃，有利于试剂的稳定。

(2)输入MLE卡信息每一个新试剂盒在使用之前，首先要使用试剂盒中的MLE卡向仪器（VIDAS或Mini-VIDAS)输入试剂规格（或出厂的校正曲线数据），否则方法将无法运行。每一盒试剂只需输入一次。可以使用MLE卡自动输入或手动输入。自动输入MLE卡信息时，卡正面向上放入塑料托盘，再将托盘箭头朝上放入仪器色测试仓，选“Calibration”菜单→“Read master lot”→选定放卡的测试仓。几分钟后仪器完成MLE卡的信息读入。一个新试剂盒在输入MLE卡信息之后，需使用试剂盒内的校正液进行校正，以后每14d进行一次校正。此项操作可以提供仪器特定的校正曲线。

(3）标本制备将增菌肉汤预温至41℃。以无菌方法向消化袋中加入25g (25mL）各类食品。在41℃±1℃消化与孵育6-7h。取1mL预增菌肉汤接种于9mL含头孢克肟和亚碲酸钾的麦康凯肉汤，在35-37℃孵育（(18±1) h。孵育之后，取1mL增菌肉汤加入试管中，在100℃水浴中加热15 min。剩余增菌肉汤存于2-8℃，以备对阳性检测结果确认。

(4）仪器检测

①打开仪器后部电源线旁的电源开关，仪器自检正常后出现主菜单，待其预热约30min即可开始检测工作。

②冰箱中取出VIDAS ECO试剂盒并使其恢复到室温（最少30min)。从试剂盒中取出所需试剂，并将未用的试剂放回2-8℃储存。用封口条将SPR储存袋重新封好。在ECO试剂条的空白处标上样本号。

③输入所需的信息以便建立work list。指定检测位置，“A”仓，按压“检测项目”选择键，直至出现要检测的项目ECO代表大肠埃希氏菌0157。在显示检测位置屏幕，依次做标准、C1和C2，键入“ECO”，至检测编号，再输入将要检测的实验号。

④分别吸取500uL标准，对照和煮沸的样本（冷却后）加入试剂条样本孔中央。将SPR和试剂条放入VIDAS相应的位置。核对位置以确保SPR上3个字母编码的颜色标记与试剂条相符。

⑤然后启动检测，所有分析过程均由仪器自动完成。检测约需45min。

(5）检测结果检测完成后，结果由计算机自动分析，并给出结果。对于阳性结果要进一步确认。将储存于2-8℃的CT-MAC肉汤连续10倍稀释，取适当稀释液置于SMAC和CT-SMAC平板，在35-37℃孵育18-24h。在CT-MAC和SMAC平板上，大肠埃希氏菌0157, H7株（山梨醇阴性）呈现中心黑色的无色菌落，需对其进行生化和血清学鉴定。山梨醇阳性的菌落在此平板上呈现粉红或红色。

1.3应用范围及优缺点

致病菌筛选定（<48h)，检测速度快，标准化分析，节省手工步骤。但此方法的阳性结果需进一步确认，所以该方法最适合食品中致病性微生物的快速筛选。

二、 ATB new半自动细菌鉴定和药敏分析系统

2.1 ATB new细菌鉴定系统基本组成介绍

ATB new是生物一梅里埃公司产品，基本组成为：①ATB主机（包含电脑）；②电子比浊器；③电子加样器；④API/ATB new鉴定分析软件和专家软件系统；⑤打印机；⑥ATB操作手册。

计算机程序包括ATB和API的鉴定数据库、ATB的药敏数据库、数据储存和分析系统及药敏专家系统。鉴定和药敏反应板在机外孵育后，一次性上机读取结果，由计算机进行分析和处理，并报告细菌鉴定和药敏结果。ATB系统是由API金标准改良而成，拥有庞大的细菌资料库以及严格的质控，可鉴定多达550种细菌。另外，ATB系统操作方便，只需将培养结果输入电脑，就可得到结果。

2.2、测定原理

ATB生化鉴定卡采用比色法进行结果判读根据各项生化反应结果，采用八进位制数码鉴定原理，把三个生化试验编为一组，其顺序代号分别是1, 2, 4三个数字，凡结果阳性者记“＋”，阴性者记“一”。将每组生化反应阳性者的代号数相加即得编码数，全阳性编码为7，全阴性编码为0。得到一个11位数的生物编码，系统自动在数据库中搜索结果，药敏卡采用比浊法来测定其药敏性，系统自动在数据库中搜索结果，并报告细菌鉴定和药敏结果。

2.3、使用方法

(1)制菌液标本得到纯菌落，进行初步鉴定选择试剂条。选择待鉴定的菌落接种于生理盐水中混匀后用标准麦氏比浊仪调整至一定浊度，然后去一定量菌悬液于ATB培养基中混匀后接种。

(2）标记卡 将密封包装打开，取出ATB生化鉴定卡和药敏卡，标明试验菌株、日期和试验者，并恒温至室温。

(3)接种用自动加样器按ATB生化鉴定卡和药敏卡的规定的加样量分别吸取并进行连续或间歇加样。当吸取菌悬液液后，加入ATB生化鉴定卡和药敏卡每个孔内，ATB生化鉴定卡32E和药敏卡每个小杯的加样量不同。如果要做氧化发酵试验，则需要在分隔室中加入液体石蜡，使其封盖菌液面。

(4）培养将接种的ATB生化鉴定卡和药敏卡放入装有水的培养盒中或浅碟上，置35℃培养24h。

（5）鉴定在ATB生化鉴定卡的部分小杯中加入相应的反应试剂，然后把ATB生化鉴定卡放入ATB new结果阅读器自动判断每个反应的颜色。把ATB药敏卡放入ATB new结果阅读器自动判断每个杯其浊度变化，然后仪器综合后自动检索，打印结果。

三、全自动微生物鉴定及药敏分析系统VITEK

3.1 VITEK基本组成介绍

VITEK AMS系列全自动微生物分析系统是法国生物一梅里埃公司生产的全自动微生物鉴定和药敏分析系统。VITEK AMS是由生物-梅里埃公司生产的第一代产品，有以下四个规格：VITEK-32, VITEK-60, VITEK-120和VITEK-240。由计算机主机、孵育箱／读取器、充填机／封口机、打印机等组成。充填机／封口机3min内把样本注入试验卡中及封口；读取器／恒温箱自动恒定培养温度并同时读取卡内生化反应变化（系统依据不同型号，容纳32-480张卡不等），电脑主机负责分析资料的储存、系统的操作及分析程式的运作。

VITEK-2是生物-梅里埃公司开发的新一代微生物分析仪，其工作原理与VITEK AMS没有大的差别，但它的容量更大，自动化程度更高，并且使用64孔的反应卡片，鉴定更准确可靠，可同时测定20种抗生素的药敏试验。VITEK-32和VITEK 2的硬件组成。

3.2检测原理

仪器的原理其实就是进行细菌鉴定中使用的生化反应。仪器把30个对细菌鉴定必需的生化反应培养基固定到卡片上，根据不同微生物的理化性质不同，采用光电比色法，测定微生物分解底物导致pH改变而产生的不同颜色来判断反应的结果。由计算机控制的读数器每隔lh对各反应孔底物进行光扫描并读数一次，动态观察反应变化。一旦鉴定卡内的终点指示孔到临界值，则指示此卡已完成。系统最后一次读数后，将所得的生物数码与菌种数据库标准菌的生物模型相比较，得到相似系统鉴定值，并自动打印出实验报告。

3.3使用方法

(1) VITEK AMS使用方法

①在试卡上填上标本号，VITEK会自动识别此号码。

②将菌落分离，加盐水后利用一支L形吸管，准备将菌液传送到卡内。

③将试卡放入充填器，用真空原理，菌液会吸进试卡的每个小孔内，将底物溶解，然后封口。

④将鉴定或药敏试卡放入培养／读数箱内。

(2) VITEK-2使用方法

①标本的稀释：选取经纯培养18-24h后，待测菌落，置于装有3mL 0.45% 氯化钠溶液的试管中进行稀释，用标准比浊计调整菌液浓度达到测试卡所要求相应标准度。

②卡片充样：从冰箱中取出测试卡，放置2-3min，使温度与室温相同。将测试卡放在载卡架上，输样管浸入装有待测菌液的标准管中。将载卡架放入仪器的填充仓填充接种。填充完毕后，在10min之内取出并放入装载仓。

③扫描条码：仪器自动扫描条码，审核所有输入的卡片信息是否正确，确认无误后自动进行封口和上卡。

3.4应用范围、优缺点

(1)应用范围是医院、卫生防疫、商品检验、环境保护、畜牧业等领域细菌检验的重要设备。根据细菌生化反应特征，通过比色、自动编码、检索系统对细菌进行鉴定，得到准确的鉴定结果。主要对进出口食品检验中发现的可疑致病菌进行最后鉴定。根据需要鉴定的微生物的种类的不同，设计了不同的鉴定卡片，比如革兰氏阴性菌卡、革兰氏阳性菌卡、酵母菌卡等。VITEK可快速鉴定包括各种肠杆菌科细菌、非发酵细菌、苛氧菌、革兰氏阳性球菌、革兰氏阴性球菌、厌氧菌和酵母菌等500种病原菌。

(2)优点VITEK AMS鉴定结果与传统方法的18-24h相比，平均只需4-6h。对与快速生长细菌（大肠埃希氏菌、粪肠球菌、变形杆菌、克雷伯氏菌等）鉴定可提前到2h。操作简便，全部操作自动化，只需操作基本步骤。数小时内可获得试验结果（肠杆菌只需4-6h)，有时快速生长菌可在2h内报告结果使用灵活，随时放入试卡进行测试，VITEKSR测试容量可扩充由32-480张卡。准确可靠，一般常见的细菌均可准确的鉴定出来，获得AOAC国际认证，保证提供的微生物鉴定结果是公认的。因此VITEK试卡是封闭式的，只有一个小孔与外界相通。一旦堵住小孔，试卡将被完全密封，因此该仪器的生物安全性非常高。

VITEK-2作为最新一代的全自动鉴定及药敏分析系统，已经得到了很多人的认可，自动化程度最高。只剩下一个最基本（却也是最重要）的操作—调配菌悬液。菌谱扩大。新卡的使用使得革兰氏阳性球菌菌谱、革兰氏阴性杆菌菌谱扩大了1倍。但要注意的是所挑菌落必须是新鲜菌的纯菌落，杂菌会出现错误的生化谱，而且菌悬液一定要混匀，并调整到一定浊度。

(3)缺点判断是某种菌的可能性高。有时也需要进行其他一些试验来进一步确定，比如血清学反应等。生物-梅里埃公司的微生物鉴定仪是全世界最好的，但因微生物鉴定工作的特殊性，其仍不能完全代替人工。

四、BD BBL Crystal^TM细菌鉴定系统

4.1BD BBL Crystal细菌鉴定系统基本组成介绍

(1) Crystal硬件组成 Crystal硬件由电脑、AutoReader自动判读仪、打印机及标准麦氏比浊仪组成。

(2) Panel（试剂板）种类及接种肉汤介绍Panel共六种，分别为RSE（快速粪肠）、N/H（奈瑟氏／嗜血）、ANR（厌氧）、RGP（快速革兰氏阳性）、E/NF（肠／非发酵）和GP（革兰氏阳性）。

试剂盒中包含接种肉汤，无需配制。接种肉汤是预先配制好的培养基，装在一次性肉汤管中。试剂板，独立包装，在收到试剂时，立即放入2-8℃冰箱保存；盛液盒，放置在2-30℃无尘环境中；接种肉汤，放置在2-25℃的环境中。

(3）比浊仪介绍标准麦氏比浊仪，用来测肉汤中菌悬液的浓度，使用前要先校正再测量。

4.2测定原理

BD BBL Crystal^TM细菌鉴定系统属于自动化程度高的仪器，是一个全新的菌型鉴定的模式，有全封闭的检测系统，利用荧光、显色和改良传统底物，用于分离自样本中的常见病原菌的菌型鉴定。将传统的酶、底物生化反应与先进的荧光增强技术相结合，时间测速度明显提高，可在4h内完成大多数致病菌的鉴定实验。

4.3接种及培养

实验标本要求纯分，对于接种E/NF, RSE板的细菌菌龄应在18-24h；对于某些生长缓慢的细菌接种N/H, GP, RGP, ANR板的应在24-48h。

①CrystalSpec比浊仪配制一定浊度的菌液，浊度要求如下。

②将配制好的菌悬液倒入盛液盒的顶端。

③手持盛液盒的两端，左右摇晃，使菌液沿轨道均匀充满每一孔，并将多余菌液回流到盛液盒的顶端。

④试剂板和盛液盒合上，并做标记。

⑤将接种完成的鉴定板，标签朝下放置托盘中。

⑥将托盘放入35-37℃非CO₂的孵育箱中孵育一定的时间。

⑦将孵育完成的鉴定板取出，在CRYSTAL AutoReader上判读鉴定结果。

4.4中文软件及AutoReader的使用

（1）点击BBL Crystal图标，打开BBL Crystal软件。

（2）输入用户名BBL Crystal，密码BBL进入使用界面。

（3）点击数据输入菜单。

（4）AutoReader自动开门，将鉴定板放入AutoReader 。

（5）输入标本信息（标本号、患者姓名等）。

（6）选择鉴定板种类。

（7）选择附加实验（氧化酶、吲哚）。

（8）点击扫描键。

（9）扫描完成，从AutoReader取出鉴定板。

（10）点击添加键存盘，输入新的标本。

（11）点击ID键，进行鉴定。

（12）查阅鉴定结果，点击复查键。

（13）在复查界面，可进行修改，打印。

4.5主要优点及其注意事项

一个全新的菌型鉴定的模式，可一步法接种菌悬液，无需添加试剂，无需加样器或滴管，无需液体石蜡覆盖。有大于500种微生物的菌种库，判读结果快速简便，准确可靠，灵敏度高。缺点是：菌落必须纯分，只适用于菌种的最后鉴定，不适用于致病菌的快速筛选。

BD BBL Crystal^TM细菌鉴定系统使用时应注意事项如下。

①用新鲜的纯分过的细菌菌落，并使用适合的培养基分纯细菌，勿使用含抑制剂的平板。

②不同的鉴定板需配置特定的菌液浓度。

③接种完成后，尽快将鉴定板装在托盘中，放入培养箱。

④在鉴定板判读时，输入正确的附加实验结果。

⑤AutoReader每2周需用参考板定标一次。

使用自动化鉴定仪的进行食品微生物检验在快速的同时也有其局限性。

①自动化鉴定系统是根据数据库中所提供的资料鉴定细菌，目前为止，尚无一个鉴定系统能包括所有的细菌鉴定资料，对于数据库中没有的细菌则鉴定不出来。

②通过自动化鉴定仪得出的结果，必须与已获得菌落特征及生理生化特征进行核对，以避免错误的鉴定。

③有的仪器操作技术要求严格，实验室人员必须经过培训合格上岗才能保证结果的准确性。