按目前我国国情，多数实验室的实验器材还达不到全用一次性规格化商品的条件，为节省实验经费，器材常需要经洗刷和灭菌处理后循环应用。在细胞培养中，器材的清洗和消毒灭菌是非常重要的环节，而且工作量很大，对实验器材的清洗消毒处理不当，常常影响工作的顺利进行，有时会前功尽弃。清洗和消毒灭菌的主要目的是清除杂质和微生物，使在细胞培养用的一切器皿内不残留任何影响细胞生长的成分。

（一）实验室处理

1．定期打扫无菌室每周打扫一次，先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等，然后用3%。甲酚或者0.05％～0.1％苯扎溴铵，或者0.5％过氧乙酸擦拭。

2. CO₂孵箱（培养箱）灭菌先用0.3％苯扎溴铵擦拭，然后用75％乙醇或者0.5％过氧乙酸擦拭，再用紫外线灯照射。

3．实验前、后的实验室处理打开紫外线灯、三氧杀菌机、空气净化器系统各作用20～30分钟，凡是带入超净工作台内的装有消毒乙醇,PBS、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用75%乙醇擦拭瓶子的外表面；实验后要用75％乙醇（或0.3％苯扎溴铵）擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台等。

4．试验用过的和被污染的物品，包括可重复使用的和将要丢弃的，带出实验室后均应高压灭菌处理；实验中处死的动物，也要先经高压灭菌后再送动物焚烧炉处理。

（二）洗刷

1．玻璃器皿的洗刷玻璃器皿的清洗是组织培养中工作量最大，质量要求也是最严格的。不仅要求干净透明、无油迹，而且不能残留任何物质，最终冲洗后，器皿从水中捞起时内外应无水珠积聚。为保证达到这一目的，玻璃器皿的清洗应按以下程序认真执行，包括浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤。

(1)浸泡：新购进的玻璃器皿和培养用后的玻璃器皿都需先用清水浸泡，以便去除表面灰尘和软化、溶解掉附着物。新购的玻璃器皿表面常呈碱性并带有许多干涸的灰尘和一些对细胞有毒的物质，如铅、砷等。使用前先用自来水简单冲刷洗，再浸入5％稀盐酸溶液中浸泡过夜，中和其中的碱性物质。用过的玻璃器皿常常附有大量的蛋白质，干涸后难于刷洗掉，因此用后要立即浸入清水中，并注意让水灌满瓶皿中，以利充分浸泡水洗。对已用过且有污染的器皿必须先消毒灭菌后再浸泡冲洗。

(2）刷洗：应选用软毛刷蘸优质的洗涤剂洗刷，不宜用力过大和刷洗的次数太多，否则会损害器皿表面光泽度，影响细胞生长分布，更不能使用含砂粒的去污粉和劣质洗衣粉。洗刷是要轻拿轻放，以免碰碎器皿等，更要注意不要被破碎的玻璃伤了自己。

(3)浸酸：刷洗后的玻璃器血需干燥后才能浸入酸性清洁液（清洁液由重铬酸钾、浓硫酸和水按一定比例配制而成，配方见表1-1)中浸泡12小时，然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗15次，最后蒸馏水冲洗3～5次和用双蒸水过3次。有些刷洗不掉的极微量杂质在硫酸和重铬酸钾清洁液的强氧化作用下可被除掉。清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用，去污能力很强。浸泡时，器皿内要充满清洁液，勿留气泡。浸酸时间按器皿的所需清洁度和清洁液的硫酸浓度来决定，若浓度高可少至数小时，一般均应浸泡过夜。主要用于新购置第一次使用的玻璃器材。操作时应注意安全，须穿戴耐酸的围裙和手套，保护好面部、眼睛和身体裸露部分。

(4）冲洗：刷洗和浸酸后均应用水充分彻底清洗，不留任何残迹。用洗涤装置可保证冲洗效果，节省人力。若用手工操作，需每瓶都用水灌满，倒掉，重复10～20次以上，最后同样用蒸馏水漂洗3次，晾干备用。

【附】清洁液的配制见表1-1。配制时要注意配液程序和个人防护，程序是首先将重铬酸钾溶于蒸馏水或自来水中，取量按表1-1。然后再将浓硫酸慢慢加入至重铬酸钾溶液中，加酸时一定不要过急，否则产热量过大，易发生危险。个人防护是指在配制时须穿戴耐酸的围裙、手套和高腰水靴，戴眼镜保护眼睛，动作要准确和小心。配制容器应用陶瓷或耐热塑料制品，不要用玻璃容器。经清洁液处理后的容器必须彻底冲洗，极微量残留也会对细胞生长不利。

清洁液配制的注意事项：

(1)选用耐酸塑料桶或不锈钢桶配制为宜，搪瓷桶的内面不得有裂纹。

(2）先将重铬酸钾溶于水中（用玻璃棒搅拌助溶，有时不能完全溶解）。

(3）正确的顺序是将浓硫酸缓慢加到重铬酸钾液中，绝不能将重铬酸钾液倒入浓硫酸中！而且要切忌过急，倒入过急将产热而发生危险。

(4)清洁液配好呈棕红色，待变绿色时表明失效。由于清洁液的腐蚀性极强，配制与应用时必须小心，并做好个人防护。

2．塑料器皿冲洗与处理目前我国组织细胞培养中所用塑料器皿，包括培养瓶皿、培养板和移液器吸头、离心管、appederf管、冻存管和瓶盖等，是一种无毒的、灭菌包装的一次性使用商品，打开包装即可使用，用后经适当处理后弃之。若消耗量大、价格较贵又未污染的器材想反复再用，需经自来水充分浸泡，再用流水冲洗，塑料器皿质地柔软，不用毛刷刷洗，以防划痕。如果残留有附着物，可用脱脂棉轻拭后流水冲洗→晾干→2% NaOH浸泡过夜→自来水冲洗→2％～5％盐酸浸泡30分钟。自来水冲洗。蒸馏水漂洗3次、晾干后包装，以备灭菌。注意有些塑料不耐高温高压，需用紫外线照射或，射线（钴一60 20000～100 000rad)照射等处理，后者对塑料制品的灭菌效果最好。

3．胶塞等橡胶类用品的处理细胞培养使用的橡胶类制品主要是胶塞。新品带有大量的滑石粉，应先用自来水冲洗干净，处理程序是用2% NaOH煮沸15分钟→自来水冲洗→2％～5％盐酸煮沸15分钟→自来水冲洗5次以上→蒸馏水冲洗5次以上→蒸馏水煮沸10分钟，倒掉废水让余热烘干胶塞备用。或蒸馏水冲洗晾干，整齐摆放于小型金属盒内经101. 3kPa高压灭菌。每次用过的胶塞置入水中浸泡，可用2% NaOH煮沸处理10～20分钟，以除去附着的蛋白质。再用1％稀盐酸浸泡30分钟左右，最后用自来水冲洗和蒸馏水清洗3次，蒸馏水煮沸10分钟，趁热倒掉热水以余热烘干使用；也可用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干或晾干，最后装入金属盒内经高压灭菌，烘干备用。胶质吸头可用75％乙醇浸泡5分钟，然后紫外线照射后使用即可。

4．金属器械的清洗与处理新购进的金属器械常涂有防锈油，先用蘸有汽油的纱布擦去油脂，再用水洗净。金属器皿不能泡酸，清洗消毒时可先用洗涤剂刷洗，后用自来水冲干净，然后用75％乙醇擦拭，再用自来水冲洗，然后用蒸馏水冲洗，再烘干或空气中晾干。使用前以蒸馏水煮沸10分钟，或包装好以101. 3kPa高压20分钟，再烘干备用。

5．除菌滤器的处理细胞培养用液，包括人工合成培养基、酶溶液、各种生长因子等，在高温下会变性失活，不能用高压灭菌，均需用滤器过滤除菌。如果除菌滤器本身处理不当，会直接影响细胞培养的质量，许多培养物污染或细胞死亡的原因是来自除菌滤器的毛病。

(1)玻璃滤器：新购置的玻璃滤器（选择G5, G6 )，首先用清水冲洗干净，晾干后将滤器内装满清洁液，下接滤瓶，让清洁液自然通过滤板滴落，将滤器内清洁液全部滴完，换蒸馏水连续抽滤，直至滤过的蒸馏水其pH为中性为止。也可先用1：1氨水中和抽滤，再换蒸馏水抽滤，直抽滤到pH为7.2左右。使用过的玻璃滤器，用蒸馏水将内外冲洗干净，再用蒸馏水连续抽滤3满瓶。晾干、包装，用101. 3kPa高压灭菌20分钟或160℃干烤2小时灭菌，备用。

(2）蔡（Seitz）氏滤器：用蒸馏水洗净金属滤器，晾干。将石棉滤板（规格EK,EKs）夹在滤筒和漏斗之间，滤板光面向下，用螺丝或弹簧夹将上下两部分夹紧，包装，用101.3kPa高压灭菌20分钟。不锈钢正压式滤器必须清洗后经高压蒸气灭菌后方可使用（图1-3)。

(3)微孔滤膜滤器：由塑料制成，分上、下两部分，上部分接注射器，下部分接滤过无菌瓶，中间夹有纤维薄膜滤片（图1-4)。塑料滤器不能泡酸液，用NaOH泡6～12小时，蒸馏水冲洗，或煮沸20分钟，晾干后包装、灭菌。在包装之前要装好滤膜两张，注意光面朝上（凹向上），安装滤膜时将螺旋稍微拧松一些（拧力均匀，以防将薄膜挤裂），码放在金属盒内，121℃高压蒸气灭菌20分钟，再烘干备用。注意在超净台内取出使用时应该立即将螺旋旋紧。购买的一次性无菌包装的微孔滤膜滤器，无需处理，使用方便。

(4）注意事项：

1)严格执行高压锅的操作规程：高压灭菌时，先检查锅内是否有水，以防高压时烧干，水也不能过多，因其将使空气流动受阻，会降低高压消毒效果。检查安全阀是否通畅，以防高压时爆炸。

2）安装滤膜时注意位置，蔡氏滤器的石棉滤板要求滤板光面向下，而微孔滤膜的光滑一面是正面，要朝上，否则起不到过滤的作用。

3）注意人体的防护：操作时要注意安全和效果，①泡酸时要戴耐酸手套，防止酸液溅起伤害人体；②从酸缸内捞取器皿时防止酸液溅到地面，会腐蚀地面；③器皿浸入酸液中要完全，不能露顶和留有气泡，以防止泡酸不彻底。