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细胞培养用液

发布时间:2017-03-09 00:00 作者:中国标准物质网 阅读量:690

针对各种细胞的培养已设计出相应合适的培养基,但都包括最基本的,细胞培养所必需的营养物质搭配,由必需氨基酸和非必需氨基酸维生素葡萄糖、无机盐和作为生长因子、激素与贴壁因子来源的血清组成。有时还会根据某些特殊细胞培养的特点,补充这些细胞所依赖的特殊成分,如胰岛素等激素,嘌呤和嘧啶稀有金属等。在大多数培养基中加入酚磺酞作为pH指示剂,以培养基的颜色变化即刻判断细胞的生长状况,另外在培养基内加入抗生素以使污染降至最低。

一、培养用液的种类与基本要求

(一)种类

培养用液是维护组织细胞生存、生长及进行细胞培养各项操作过程中所需的基本溶液。主要包括平衡盐溶液、培养基和培养用试剂等三大类。平衡盐溶液是细胞培养中常用的基本液体,常用的平衡盐溶液见表1-5;培养基可分为天然培养基及合成培养基;在细胞制备和培养过程中还需使用一些培养用试剂,包括组织消化液、pH调节液和抗生素等。

1,平衡盐溶液平衡盐溶液(balanced salt solution, BSS)具有维持渗透压,调控培养环境酸碱平衡的作用,并可供细胞生存所需的能量和无机离子成分,另外尚可作为洗涤组织、细胞以及配制各种培养用液的基础溶液。常用的平衡盐溶液有Hanks液和PBS液等。

2.培养基培养基是维持体外培养细胞生存和生长的基本溶液,可分为天然培养基和合成培养基两大类。

(1)天然培养基:天然培养基(natural medium)主要来自动物的体液或从组织中分离提取成分,其营养性高,成分复杂,但来源受限,而且存在较大的个体差异。天然培养基的种类很多,包括生物性液体(如各种血清)、组织浸出液(如胚胎浸液)和凝固剂(如血浆)等。

(2)合成培养基:合成培养基(synthetic medium)是对细胞体内生存环境中各种已知物质在体外人工条件下的模拟。这种模拟人或动物体内环境合成的培养基,是在体外经过反复试验和筛选,进行强化和重新组合形成的配方恒定的培养基,给细胞提供了一个近似体内生存的环境,是较为理想的培养基。但需与天然培养基混合使用,才能使细胞生长和繁殖。常用的培养基有DMEM, RPMI 1640和199培养基等。

3.培养常用试剂

(1)消化液:常用的消化液有胰蛋白酶乙二胺四乙酸二钠(EDTA)和胶原酶等,它们在制备原代细胞时可消化组织、分散细胞;在细胞传代时使细胞脱离瓶壁并使细胞团分散成单个细胞。

(2) pH调整液:为了维持培养液恒定的pH,以利于细胞的生长和增殖,常在培养基使用前用pH调节液(常用NaHC03)来稳定营养成分,为防止培养基的pH在培养过程中迅速变化,可利用N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸(N-2-hydroxyethylpiperazine N' -2-ethanesulfonicacid, HEPES)强缓冲液维持pH。

(3)抗生素:用于获取生物材料时的无菌操作,处理取材于污染环境中的标本材料,以及预防培养物的污染。常用青霉素、链霉素和抗真菌素等。

(二)基本要求

因为培养液是细胞生存的环境,其要求严格,对其各种成分都需要精心选择。

1.细胞培养对水的要求水不仅是细胞的主要成分,也是细胞赖以生存的主要环境,营养物质、代谢产物都必须溶解在水中,才能被细胞吸收和排泄。体外培养细胞对水的质量非常敏感,要求很高。水的纯度不够,即使有害元素含量极少,对细胞也会产生不利影响,有时引起细胞中毒死亡。因此配制所有的培养液和各种溶液应使用纯化水。组织培养必须使用玻璃蒸馏器制备的三次蒸馏水。二次蒸馏水或一次蒸馏水可用以清洗器皿或配制一般洗液。实验室纯化水的常用装置有两种:

(1)离子交换装置:此装置用离子交换树脂可有效地去除离子,所制得的水称为去离子水。制取去离子水不用燃料、成本低、水质好、操作简便,但不能去除非离子物质或有机质,因此组织培养中很少使用,仅用于冲洗玻璃器皿。

(2)蒸馏水装置:蒸馏水符合组织培养的要求,而且必须使用玻璃蒸馏器制取,因用金属蒸馏器不能完全排除金属离子,故不符合要求。有时为制取大量高质量纯化水,可用去离子水经玻璃蒸馏器重蒸。组织培养用液需用三蒸水配制。

蒸馏水一般是现用现配,存放时间不宜过长,最好不要超过2周。因空气中的杂质和有毒气体能污染水质,C02也会溶解于水,故存放时要将蒸馏水装满贮存容器,密封瓶口防止空气混入。

2.对试剂纯度和质量的要求细胞培养对配液的试剂要求很高,要使用高纯度的物质配制细胞培养用液。试剂常用的纯度有优级纯(特级纯)、分析纯(AR)和化学纯(CD),细胞培养配液用的物质要选择分析纯以上级别。很多用于培养用液的化学物质很难溶解,在配制时必须设法使其溶解,而且要按规定的先后顺序配制,称量要准确,要看清化学物质的规格、纯度、结晶水的数量等,切勿搞错。

3.培养用液要求严格无菌培养用液的污染肯定要引起细胞培养的失败。在灭菌处理时要考虑化学物质的特性,切勿在灭菌过程中也灭活了化学物质的活性,所以要选择正确的灭菌法进行有效的处理。关键是要在无菌条件下直接配制,培养用液多采用过滤除菌法;因有不少物质的性质不稳定,在高温高压下易产生变性,如葡萄糖在115℃条件下只能维持15~20分钟,若超过115℃葡萄糖就会破坏。将配制的溶液冻存时也要考虑其性质,不要因冻存或反复冻融而使物质变性,影响细胞培养结果。

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