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培养细胞基因导入技术

发布时间:2017-03-09 00:00 作者:中国标准物质网 阅读量:434

基因转导技术(gene transfection technology)是将外源性基因采用分子生物学技术,人工导入细胞,观察它在细胞中的表达,研究其生物学特性和功能。细胞内基因转导包括染色体转导和基因转导,其涵盖内容见图3-5。染色体转导包括全套染色体和分离提取的细胞核或DNA大分子片段,因导入的基因太大,只能采用细胞融合技术或用显微注射法将其导入细胞内,并与受体细胞发生DNA整合,以研究整合的细胞特性和功能;基因转导是将已克隆的目的基因(包括基因的DNA片段或序列),导入离体细胞中进行表达的方法。基因转导包括基因转染(gene transfection)和转基因技术(transgenic technique)两种方法,前者针对体细胞,是将目的基因导入体外培养的细胞或导入从体内取出的细胞中(如淋巴细胞等),观察目的基因在细胞中的表达;后者针对生殖细胞,是将目的基因导入受精卵,再将导入基因后的受精卵植入子宫,发育成胚胎和个体,可在胚胎期和出生后观察目的基因在整体内的表达。转基因技术所产生的动物称转基因动物(transgenic animal),该技术目前仅用于动物和植物。

基因转染常用的方法有磷酸钙沉淀法、DEAE-葡聚糖法、脂质体法、电击法(电穿孔技术)、细胞显微注射法等,均属于物理和化学方法的转染技术,各种转染方法都存在条件优化的问题,每种细胞对外源DNA的最佳导入条件都有特定的要求。对于贴壁细胞系,可用DEAE一葡聚糖磷酸钙及脂质体介导的转染方法试验;对于非贴壁细胞系,可用电穿孔或脂质体介导的转染方法进行转染等。但理化法转至细胞内的基因一般均不能与细胞染色体发生整合,而是在胞质内呈现暂时性表达,不能持久,会随时间推移逐渐减弱或消失。为使目的基因进入细胞后能与细胞基因组DNA发生整合,产生长期的表达,常用生物法转染技术,即用反转录病毒、腺病毒等改建的病毒载体,将目的基因导入细胞与细胞基因组整合。根据不同的实验目的,外源DNA导入哺乳动物细胞又可分为瞬时转染和稳定转染,瞬时转染一般是将外源DNA导入细胞1~4天后收获转染细胞,并对被转染基因的复制和转录产物进行分析;而稳定转染则需要使外源基因整合于细胞染色体,从而得到稳定的转染细胞株。以上各种方法均可用于瞬时转染;除DEAE-葡聚糖转染方法外,其他各种方法均可用于稳定转染。导入基因获得表达是一个非常有用的方法,通过表达一些细胞因子或其他功能基因,获得该基因的功能及调控,还可以用于基因治疗。


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