外源基因导入细胞的化学法主要有三种，如磷酸钙共转染法、DEAE-葡聚糖介导转染法和脂质体介导转染法等，其中脂质体介导转染法的转染效果较高，使用简便，而且不少厂家可提供脂质体转染的试剂等，目前被多数实验室所采用。

（一）脂质体介导的转染

【原理】

脂质体（liposoms）是一种人造膜，制备包装DNA的脂质体，一般是用逆相蒸发（reverse phase evapolation )技术，因此可生产大型的、包装着高效DNA的单层膜脂质体载体。脂质体介导转染技术的原理是细胞膜表面为负电荷，而脂质体颗粒带正电荷，可通过电荷间的引力将DNA,mRNA或单股RNA等导入细胞内。其实，用脂质体将DNA导入细胞的机制并不是很清楚，一般认为，DNA上带负电的磷酸基团与脂质体上的正电荷结合，然后脂质体上剩余的正电荷与细胞膜上的唾液酸残基的负电荷结合，通过两者的融合将DNA导入细胞。另一种可能的机制是DNA与脂质体结合之后通过细胞的内吞作用进入细胞，然后一部分DNA通过不明机制释放进细胞质。

脂质体载体有许多优点。例如制备程序比较简单，可以通过多聚碳酸酯滤膜消毒灭菌，用它包装的DNA在4℃可长期保存不失活性，以及毒性低，包装容量大，可保护DNA免受核酸酶的降解作用等。

【材料】

1．待转染细胞贴壁单层细胞或悬浮培养细胞；

2．试剂DMEM-SF无血清无抗生素培养基），DMEM完全培养液（含15％胎牛血清），胰蛋白酶，质粒DNA，脂质体转染试剂（lipofectamine) ,1xPBS ( pH 7.4)。

3．器材35 mm培养皿、试管、EP箱、移液器、Tip头、离心机、涡流混旋器、超净工作台、C0₂孵箱等。

【方法】

1．贴壁细胞

(1)质粒的准备：用于转染的质粒量一般较大，所需的纯度也较高，而且质粒的构型最好是共价闭环的。所以推荐采用的质粒DNA需大量制备，而且在操作过程中要轻盈。提取的质粒需进行纯化，如用氯化铯密度梯度离心法、聚乙二醇沉淀法等。在质粒纯化的最后一步，质粒沉淀时应是无菌操作，70％的乙醇漂洗，于超净台内吹干，溶于无菌水内。

(2）收获细胞：收集经胰蛋白酶消化的脱壁细胞，将（1～2)x10⁵细胞重悬浮于2mlDMEM完全培养液中，接种于35 mm培养皿或6孔培养板中，置37℃,5% C0₂孵箱中培养18～24小时，使细胞达到50％～80％汇合。

(3）配制lipofectamine-DNA混合物

1)分别在Eppendorf管中制备溶液A和B：溶液A是将2～20 ug质粒DNA溶于100 ulDMEM-SF（无血清无抗生素培养基）中；溶液B是取20 ul lipofectamine稀释于80ul DMEM-SF（无血清无抗生素培养基）中。

2）合并溶液A和B，轻轻混合，即为lipofectamine-DNA复合物，置室温孵育15分钟，使DNA与阳离子脂质体结合。

(4）弃去培养皿或培养板中的细胞培养液，并用DMEM-SF培养基洗涤细胞1次。

(5）将0.8m1 DMEM-SF培养液加入至lipofectamine-DNA混合物中，混匀后小心滴加至待转染的细胞上，轻轻混匀，置37℃ ,5% CO₂孵箱中培养5～24小时（这个时间要根据细胞耐受无血清培养时间而定），弃去转染液，加2 mlDMEM完全培养液继续培养。

(6）在转染后48～72小时，测定细胞的瞬间表达状况；如用于稳定表达，可于转染48小时后更换选择培养基（如G418)进行筛选。

对各种类型的细胞见表3-4中DNA及脂质体的用量。

2．贴壁细胞用脂质体进行稳定转染的方法

(1)于转染前2天，用胰蛋白酶溶液消化细胞，加入完全DMEM培养基悬浮细胞，以5x10⁵／孔接种6孔培养板，在37℃,5% C0₂培养箱中培养。转染前在倒置显微镜下观察，挑选生长旺盛、形态好，细胞间有少量空隙的，约有75％的细胞生长成片的孔用于转染。

(2）将待转染的细胞用无菌PBS (pH 7.4）洗1次。

(3）在两个1. 5ml Eppendorf管中分别配制下列两种溶液：A溶液是将0.5～2 ug DNA溶于100ul DMEM-SF培养液中；B溶液是将10 u1 lipofectamine与90u1 DMEM-SF培养液混合。

(4）合并溶液A和B，轻轻混合后于室温下放置20分钟，然后加入800ul DMEM-SF培养液。将DNA、脂质体和DMEM-SF培养液混合物，滴加在待转染的细胞表面，于37℃,5%,C0₂培养箱中培养24小时。

(5）倒掉转染液，每孔加入4m1 DMEM完全培养液，37℃,5% CO₂培养箱中培养48小时。

(6)吸去DMEM，加入选择培养液稀释细胞。培养细胞适当时间以选择真正被转染的细胞克隆。

3．悬浮细胞瞬时转染法

(1)质粒的制备同上述贴壁细胞；

（2）收集细胞：用无血清培养基洗涤细胞1次，将（2～3）×10⁶,细胞重悬于0.8 ml无血清培养基中，接种于35 mm培养皿或6孔培养板内，在37℃,5% C0₂孵箱中培养。

(3)参考上述贴壁细胞转染方法制备lipofectamine-DNA混合物，将其加入至培养皿（或板）的细胞悬液中，轻轻混匀，置37℃,5% CO₂孵箱中培养5～24小时。时间长短视其细胞耐受无血清培养的时间，然后加入4m1完全培养液（含15％胎牛血清）继续培养。

(4）于转染后48～72小时，以2000r/min，离心5分钟收获细胞，检测细胞瞬时表达情况。

lipofectin与lipofectamine转染的方法基本相同。实验中不同直径培养皿的细胞转染过程，所需试剂的量请参考表3-5。

【注意事项】

1．在电泳检测基因表达情况时，关键是要定出目的基因和载体DNA的量，并要考虑最低消耗量，以保证反应体系的有效作用。

2．影响脂质体转染DNA的成功有三个主要参数，即脂质体和载体DNA的浓度，以及脂质体-DNA复合物的孵育时间。应系统地检测这些参数，以获得最适转染效率。总体来说，增加脂质体的浓度可增加转染效率；但是当浓度过高（>100g）时，脂质体可能是有毒的。当确定了脂质体和DNA的最适量后，就要决定脂质体一DNA复合物作用于细胞所需的时间。总体来说，转染效率随着细胞与脂质体-DNA复合物接触时间的增加而增加，但当接触时间大于8小时可对细胞产生毒性作用。

3．试验用Eppendorf离心管等，应选用聚苯乙烯管，而不是聚丙烯管，因为DNA/脂质体复合物可明显地吸附在聚丙烯管上，影响转染效果。