二乙胺乙基葡聚糖（diethyl aminoethyl-dextran, DEAE-dexran）是一种高分子量的多聚阴离子试剂，能促进细胞捕获外源DNA，因此被用于基因转染技术。其机制尚不清楚，可能是因为葡聚糖与DNA形成复合物而抑制了核酸酶对DNA的作用，也可能是葡聚糖与细胞结合而引发了细胞的内吞噬作用，使DNA转导进入细胞核，此法只适合暂时转染实验。

在DEAE-葡聚糖转染中，有几个可变因素：加入平皿中的细胞数量、DNA浓度、DEAE-葡聚糖的浓度和作用细胞的时间等。一般用高浓度的DEAE-葡聚糖（1 mg/ml）作用较短时间(30分钟～1.5小时）；或用较低浓度（250ug/ml)作用较长时间（8小时）两种方法来进行转染。由于DEAE-葡聚糖对细胞有毒性，所以采用低浓度长时间的方法比较可靠。

【材料】

1．配制下列溶液

（1）50mg/ml DEAE-葡聚糖（DEAE-dextran )：取100mg DEAE-dextran (Mr=500 000）溶于2ml蒸馏水中，高压灭菌。

(2) Tris-缓冲盐溶液（TBS)：取8g NaC1,0.2g KCl,3g Tris溶于800ml水中，用HCl调pH为7.4，加蒸馏水定容至l000ml，高压灭菌。分装，室温保存。

(3) Tris-缓冲盐-葡萄聚糖溶液（TBS-D）在临用前向TBS液中加入1 ml 20% (W/V）的右旋糖溶液，使葡聚糖终浓度为0.1%。

(4）悬浮性TBS溶液（STBS);25mmol/L Tris. C1 pH 7.4,137mmol/L NaC1,5mmol/L KC1,0.6mmol/L Na₂HP0₄,0.7mmol/L CaCl₂,0.5mmol/L MgC1₂。该溶液可以先配成l0x贮存液，过滤除菌，临用前用无菌水稀释成lx即可。

(5) 10％二甲基亚砜(V/V)：用PBS溶液配制，过滤除菌，室温贮存。

2.鼠成纤维细胞。

3.PSV2-neo质粒DNA。

4.DMEM培养液、6418选择性培养基。

【方法】

1．转化前接种鼠成纤维细胞，细胞浓度为5x10⁵个／TL(或培养皿），生长2～3天，当达到50％板底面积时即可应用。

2．用乙醇沉淀4 ug PSV2-neo质粒DNA，空气干燥后溶于40ul TE中，或取供体DNA。

3．转化前24小时细胞应传代1次，收获对数生长期的细胞，以1～5xl0⁵个细胞／培养皿的密度接种细胞。加入完全培养基，37℃,5% C0₂培养。转染前，在倒置显微镜下观察培养细胞，挑选生长旺盛，细胞间有少量空隙的培养瓶，倒掉培养液，用1xPBS洗2次待用。

（注意：转染时应有75％的细胞长成片，如果传代后细胞生长不足12小时即进行转化，则细胞贴壁不好，在DEAE-dextran作用时，细胞容易丢失）

4. DNA/DEAE-dextran/TBS-D溶液的准备：加质粒DNA和50mg/ml DEAE-dextran液至TBS-D溶液中，使DNA的终浓度为0.1～4 ug/ml ,DEAE-dextran的终浓度为1.Omg/ml。

5．吸去培养皿内的旧培养基，用预热的PBS及TBS-D各洗1次。

6．向培养皿内加DNA/DEAE-dextran/TBS-D溶液（60mm培养皿加250u1, 35mm的加150ul，轻轻摇动使所有细胞都接触到溶液，放回孵箱30～90分钟（时间的长短取决于每种细胞对DEAE-dextran的敏感性）。每隔15分钟摇动1次培养皿，并在显微镜下观察细胞的形态。如果细胞仍然贴壁则继续孵育，当细胞皱缩变圆时进行下一步。

7．吸去DNA/DEAE-dextran/TBS-D溶液，用预热的TBS-D和PBS各洗1次，一定注意不要将细胞吹起。

8．用无血清培养基洗3次，最后加完全培养基，于37℃,5% CO₂孵箱中培养24～60小时。以下操作过程同本节二、（二）中第2项，利用BES缓冲溶液系统的磷酸钙转染法的（6)和（7）所示。

【注意事项】

DEAE-葡聚糖与磷酸钙共沉淀法比较有三点不同：J DEAE-葡聚糖一般用于表达基因的瞬时表达，不易形成稳定转化细胞系；②由于DEAE-葡聚糖对细胞有毒性作用，所以用DEAE-葡聚糖转染某些细胞系（如BSC-1, CV-1, COS等）时，转染效率很高；而对其他类型的细胞则效率不满意；③ DEAE-葡聚糖转染所需 DNA的量与磷酸钙法相比大为减少。前者转染1x10⁷个细胞只需0.1～2ug的DNA；后者转染同量细胞则需1Oug DNA，是前者的10～100倍。DNA的量过大会加大对细胞的毒性，反而降低转染效率。

最适的DEAE-葡聚糖浓度在100～500ug/ml之间。孵育的具体时间视细胞系而定，并应进行条件优化。