流式细胞仪的应用包括两部分，即制备样品和仪器检测。第一步是样品的制备，指制备单个细胞悬液，包括悬浮生长细胞、单层培养细胞和实体组织的消化和分散等；然后要进行样品的固定，通常选用甲醛法、乙醇法和丙酮法；第二步是样品染色和检测。染色方法的选择应依据实验目的和内容而定，活细胞常用碘化丙啶(PI）进行荧光染色；DNA用标记DNA的荧光色素显示；DNA与RNA或DNA与蛋白质均用双重染色；FCM能对悬浮在液体中的细胞或生物微粒进行多参数分析，其主要的功能包括两方面。一方面是分析细胞，如测定细胞容积和形状，以及细胞内颗粒的大小与数量；对荧光色素染色的细胞标本，可测定细胞内的生物大分子如DNA,RNA、蛋白质、酶、多糖等物质的含量；应用荧光抗体能检测细胞膜上的抗原与抗体，利用激光的偏振光可以测量活细胞膜的流动性等。另一方面是分选细胞或生物微粒，如用双荧光素标记法分离高纯度的X或Y染色体，用单克隆抗体技术分离细胞亚群，用DNA和RNA双染色法可以分离不同细胞周期时相的细胞。

【材料】

1．待检细胞细胞悬液、培养细胞经分散处理后制备的细胞悬液、血液及骨髓等。

2．试剂0.0l mol/L PBS，含5％小牛血清的0.0l mol/L PBS培养液，含10％～20％小牛血清的培养液，75％乙醇，抗细胞某一表面标志的小鼠单克隆抗体腹水（一抗），FITC标记的羊（或兔）抗小鼠1g（二抗）。

3．器材毛细吸管、刻度吸管、有盖试管、微量加样器、吸头、冰箱、水平离心机、FCM。

【方法】

（一）前期准备

1. FCM的准备分离细胞前1～2天，用75％乙醇灌注FCM的细胞流动管道系统以消毒，然后以无菌生理盐水或PBS反复冲洗。

2．制备单细胞悬液样品应用流式细胞术分离细胞，要对细胞逐个地进行分析、分选，因此，待分离材料均应制备成单个细胞悬液样品。

(1)血细胞：血细胞在血液中呈游离状，从全血中分离出白细胞，用PBS调整细胞密度为107～108/ml。

(2）悬浮培养的细胞或体液中的细胞：经漂洗、清除培养液或体液，再悬浮于PBS中并调整细胞密度，即得到实验样品。

(3）骨髓细胞、脱落细胞及贴壁培养细胞的样品制备：对骨髓细胞，在采样时应避免外周血的污染。对脱落细胞要漂洗清除杂质和黏液，再调整细胞密度。

(4）贴壁培养细胞：用酶消化法分散细胞。破坏细胞外基质及细胞间连接（蛋白水解酶和钙鳌合剂EDTA处理或轻度机械破坏）目的是使之成为单细胞。加入足量的PBS, BSS或Hanks液于这些细胞中，混匀，用带4号针头的注射器强力抽吸和吹打，即可得单细胞悬液样品。

(5）实体组织的单细胞样品制备：对于实体组织，制备单细胞悬液样品可采用机械法、化学法或酶法等。

3．细胞的固定一定浓度的甲醛,70％或95％乙醇（4℃ 12分钟以上）、丙酮只能用荧光染料进行染色，获得不同参数如细胞周期、细胞表面活性。

（二）免疫荧光染色

以下是制备流式细胞术分选细胞用荧光染色样品的一般方法，对于某些特殊样品的制备，技术上可能要作一些必要的变更。

1．在试管中，每管加入1x10⁸～2xl0⁸个细胞，置水平离心机中，以1000r/min离心5分钟，弃上清液。

2．轻轻振摇试管，使细胞完全分散，每管加入500ul适当稀释度的一抗溶液，混匀，置4℃下反应30分钟。

3．取出试管，每管加入5～8m1预冷至4℃的含5％小牛血清的PBS混匀。以1000r/min离心5分钟，弃上清液。反复洗涤2～3次。

4．轻摇试管使细胞分散，每管加入500ul适当稀释度的FITC二抗，混匀。置4℃下反应30分钟。

5．同步骤3洗涤。

6．每管加入约5ml PBS，悬浮细胞，移入专用测试管。

【结果】

FCM能将研究所需要的细胞分选出来，通过超声振荡将样品和鞘流液形成小液滴，排成单列细胞通过激光束，细胞发出的荧光被检测，仪器使带荧光细胞的小液滴充电。液滴下流经过两个高压电极，充电小液滴偏向相反电荷的极侧，不带电不偏向。细胞被按照要求分选，收集在合适的容器中。FCM除可分选不同类型细胞外，还能分选不同的细胞器。

分选细胞为流式细胞术应用的一个重要方面，它是用FCM将目的活细胞从异质性细胞群中分离出来，获得高纯度的细胞制剂，以进行有关活细胞的特性及其功能的各种研究。分离的细胞以培养液洗涤后，悬浮于含10％～20％ FCS的培养液中，待用。选择好有关测定参数，调试好仪器，然后上样分离细胞。

【注意事项】

1．在制备样品时，使细胞充分离散是很重要的，故离心转速和时间是一关键因素，要使血细胞比容不过紧，又不至于丢失太多细胞；离心次数也不宜过多，以免细胞丢失或形成细胞凝块。

2．制备细胞样品一般都用适当的固定剂固定，细胞固定时间不宜过长，不要使用冰醋酸-乙醇、苦味酸及含汞的固定剂；但细胞分选的目的是获取高纯度的活细胞，故制备样品时不用固定剂。

3．为减轻本底，应将细胞表面尚未结合的荧光染料洗净；全部操作尽可能避光，以免荧光衰减。

4．进行双标记测定时，应尽量选用激光光谱不接近的荧光色素。

5．正式实验前，要进行预试，确定一抗（鼠单克隆抗体）和二抗（FITC抗鼠抗体）的应用浓度。

6．上机分选细胞前用PBS悬浮细胞时，细胞密度要求不很严格，1x10⁷～1x10⁸个／ml均可；细胞悬液中如含细胞团块，应预先以尼龙网（40～70目）过滤后再上机分离，以免堵塞管道。

7．细胞样品制备好后最好立即上机分离，如果不能立即上机，则可用避光纸包裹置4℃冰箱中，但放置时间不可过长，否则影响细胞活力。

8．调试FCM时应使用理想的标准品，以便获得较高的分辨率。

9．进行细胞周期分析时，用鸡红细胞调节仪器的变异系数在4％以下。此外，样品的变异系数不能过大，否则会影响检测的准确性。