气管是呼吸道的重要组成，气管与大支气管较多覆盖纤毛上皮，由纤毛上皮细胞，无纤毛的上皮细胞与基底细胞等构成；细支气管被覆一层纤毛上皮细胞与无纤毛上皮细胞，覆盖细胞分为扁平的I型上皮细胞和立方状的Ⅱ型上皮细胞。鸡气管上皮细胞（chicken tracheal epithelial cells, CTE）既是许多病原体作用的靶细胞，也是阻挡病原入侵的一个重要屏障。实验室可利用气管灌注冷消化法分离培养技术，获得形态完整并带有纤毛的CTE，细胞活性高，经纯化后的CTE均一性高、生长快。CTE培养对研究气管上皮细胞的增殖与分化、细胞功能及呼吸道疾病发病机制等是极其有用的，可为与CTE相关的研究提供技术支持。

【材料】

1．组织来源 1日龄鸡。

2．培养液配制含5％鸡血清（或5% FBS) DMEM或F12完全培养液：在上述无血清培养液中加入5％的雏鸡血清或5％胎牛血清，l00IU/ml青霉素、100 ug/ ml链霉素、50IU/ml两性霉素B。

3．消化液0.1％链霉蛋白酶(Pronase E )贮存液浓度（1%) 20mg/ml, -20℃保存。使用前用DMEM或F12溶解，滤过除菌，常用工作浓度lmg/ml，工作温度37℃。

4．器械与仪器无菌手术刀、剪、镊、止血钳等，200目尼龙筛网、60 mm培养皿、C0₂孵箱、倒置显微镜，低温高速台式离心机，高速微量离心机。气管套管（用聚苯乙烯管加工，弹簧夹等（结扎线，气管套管，尼龙网等均保存于75％乙醇中，用时用灭菌镊子取出）。

【方法】

1．气管摘出将鸡置于密闭容器通入CO₂ 窒息而死，用胶带将其仰卧位固定于实验台上，常规碘酊、乙醇消毒皮肤，沿颈部正中线剪开，无菌取气管到肺门，细心剥离气管周围软组织和表面筋膜，注意不要伤及小血管。于最上部的气管和食管之间穿一结扎线，在气管最上部结扎固定，结扎必须牢靠，提起并拉直气管，继续向下剥离气管至分支处，将气管最下端切开。用注射器吸取DMEM或F12液气管内外反复洗涤，去除附着的血液等，以气管苍白且无黏液为准。

2. CTE细胞的分离无菌棉线结扎气管、支气管下端肺门处，从另一端向气管腔内注射0.1％链霉蛋白酶，使气管略膨胀，说明蛋白酶充满气管内腔，并注意蛋白酶不得外漏。然后将气管浸入冰冷DMEM或F12中，4℃消化10小时。消化完毕，用DMEM或F12洗净气管外侧，然后用吸满了DMEM或F12+5%FBS液的10ml注射器插入气管内并上下抽推数次以使蛋白酶液等从气管内出入冲洗分离其上皮细胞，最后将气管下端结扎线剪断，使内液流出并通过200目尼龙网收集于50m1离心管内，1000r/min离心10分钟，去上清液，沉淀用含有5% FBS的DMEM或F12培养液再悬浮。如此再重复洗涤一次，最后用培养基再悬浮细胞并计数，通常一个气管可获得（1～3)x10⁶细胞，用锥虫蓝染色检查存活率，要求在95%左右。

3. CTE细胞的培养每个平皿可接种气管上皮细胞5x10⁴～2x10⁵/ml,37℃,5% CO₂孵箱内静置培养72小时，培养开始后数小时细胞可附着，12～24小时可完全附着，24～48小时后开始增殖，细胞在平皿底面全面铺开，即是融合状（confluent)，多层化，但无明显克隆形成。以后每隔2～3天换液1次。

【结果】

刚分离培养的CTE形态为亮球形，多呈单个存在，细胞体积较红细胞大，多数细胞纤毛清晰可见，细胞大小均匀；贴壁生长后，细胞之间结合较为松散，呈铺路石样，细胞群体均一性高。MTT染色检测细胞活性可达90%。

【注意事项】

1．虽然37℃热消化分离的CTE活性和冷消化差不多，但是后期细胞难以贴壁和无法增殖。CTE冷消化时间需要根据鸡的日龄数来优化，1日龄雏鸡以10～12小时为最佳。若超过巧小时，消化后的细胞则没有一例能成功培养。

2. CTE培养过程中能否有效消除成纤维细胞的污染，是CTE能否培养成功的另一重要因素。除可利用400目网筛滤过，还可利用成纤维细胞和上皮细胞的贴壁时间差进行分离。

3. CTE培养在无血清培养基时基本不贴壁，CTE贴壁率在含鸡血清培养基中比在含胎牛血清培养基中明显增高，且后期生长速度快。但因为血清成分复杂，同时血清的存在也容易对后期相关病毒研究起到干扰作用，所以希望能够尽快找到无血清CTE培养技术。