新生鼠心脏细胞不具备繁殖能力，故不可能传代，只能利用原代培养物。心脏细胞培养物易受培养技术水平及处理条件的影响，例如，新生鼠心肌组织对酶消化处理极其敏感。心肌细胞培养遇到的另一个普遍的问题是成纤维细胞的污染，繁殖的成纤维细胞能很快从数量上压倒心脏细胞并可能影响到心脏细胞的分化，因为成纤维细胞一般比心脏细胞更易贴壁。若需长时间培养心脏细胞，应施以诸如溴化乙锭（ ethidium bromide, EB) ,溴脱氧尿昔( bromodeoxyuridine, BrdU）等化学处理，使用不同的血清，如牛血清，能降低成纤维细胞的繁殖速率也能增加心脏细胞的收缩性能。另外，应考虑的问题是合适的接种密度，以保持健康跳动的培养物。心脏细胞培养物的伸缩性似乎和细胞与细胞之间接触有些关系，尽管形成一个融合成片的心脏的单层培养物极其困难。借助于化学处理，如施以去甲肾上腺素，或加入牛血清可以提高细胞的伸缩性。

【材料】

1．组织来源幼鼠(0～1日龄Sprague Dawley幼鼠)20～25只。

2．培养基与试剂

(1）消化液：90％加Earle's盐液的MEM，加10% FBS,O.1 %胰蛋白酶；

(2）盐水A：137mmol/L NaC1,4mmol/L KC1,4.2mmol/L NaHC0₃、5mmol/L葡萄糖；

(3）接种培养基：90％加Earle's盐的MEM,10% FBS、青霉素1001U/ml，链霉素100ug/ml，加有血清的培养基必须在30天内使用完毕；

(4）交换培养基：90％加Earle's盐的MEM,10％牛血清、100IU/ml青霉素、100ug/ml链霉素，加有血清的培养基应在30天内使用完毕。

3．器具各种吸管、离心管、三角烧瓶、烧杯，培养皿，冰台（将一只平皿装满冰后倒置即可）。

【方法】

1．组织消化和分离细胞

(1)取一只干净加盖烧杯，内放一块Metofane饱和的纱布，把幼鼠放烧杯中麻醉（20只幼鼠大约需要5分钟）。

(2)一次取出一只幼鼠，一定要盖好盖子，然后将幼鼠躺着放在一块无菌纱布上。用乙醇擦洗其胸部及腹部。把鼠肩脚骨往后夹，使突出胸腔，在肋骨下沿胸骨方向拉一口，摘出心脏放进标记为1的培养皿中。

(3）继续处理余下的幼鼠，一定要保持手套及所用器械洁净。

(4）上述操作完成后，用两把5号钳子剔除心脏上结缔组织和血块再转入标记为2的平皿中。再洗一道，转入标记为3的平皿中。

(5）取一只无菌巴斯德吸管轻轻地把平皿3中的盐水液A吸出，然后加入2ml孵育过的胰蛋白酶液。用准备好的第二把无菌解剖刀把心脏切碎成砂粒大小。

(6）把上述切碎的心脏及胰酶液转入加了搅拌子的锥形瓶中。另外吸取3 ml新鲜的胰酶冲洗平皿和剪刀并转入锥形瓶，补加胰酶至终体积10ml，加大塞子，放入37℃水浴中。打开搅拌器，调节转速至60r/min左右，消化15分钟。

(7）弃上清液，加入10ml新胰酶，用一支一次性带刻度的吸管吹打溶液两次，机械分散细胞，再孵育10分钟。

2．培养已分离出的细胞

(1)如上述消化处理之后，小心移出上清液至加有10ml冷的培养基的锥形管中，这就是第一次收集到的分离出的细胞。余下的组织块中加入l0ml新胰酶继续消化。

(2)消化的同时，上述含培养基和细胞上清液的锥形管以1200r/min离心4分钟。轻轻吸去上清液，加5 ml接种培养基重新悬浮细胞团。

(3)直至只剩余少许组织块为止。将所用细胞悬液集中于一支锥形管中。

(4)最后一次沉淀细胞，加接种培养基至l0ml，吹打几次以散开所有细胞团。

(5)将上述l0ml悬液转移到l00mm规格的无菌组织培养平皿中，于37℃,5% CO₂，高湿度的孵箱中放置1～1.5小时，目的是减少成纤维细胞的污染（这些细胞比心脏细胞贴壁快）。

(6)孵育后，收集所有平皿中的培养液（每个平皿用l0ml预温的接种培养液洗刷后收集），培养液包含非贴壁细胞（经富集的心脏细胞）。量一量最后所收集溶液的体积，用锥虫蓝拒染法计数细胞。一般总细胞数在5x10⁷～1x10⁸间，成活率约85%。

(7）用接种培养基将细胞密度调整至(5～6)x10⁵/ml，制成接种液。

(8)每只35 mm规格平皿加2ml上述接种液，60mm规格的平皿5 ml的接种液，孵育4～6小时。

(9) 4～6小时后，用培养基或盐水液A（一定要预温至37℃）轻轻洗刷平皿两次，倒掉后加入交换培养基继续孵育过夜。到第二天，大多数心脏细胞都将跳动。

(10）用培养基或盐水A（务必温热到37℃）冲洗平皿两次，加入新配制的交换培养基。继续温育，两天换一次液。