北京普天同创生物科技有限公司
消化刮取法常用于大动脉血管内皮细胞的分离和培养。
【材料】
1.组织来源一般采用死亡胎儿的胸主动脉或腹主动脉。
2.培养用试剂
(1)清洗液:HBSS,不含Ca2+和Mg2+。
(2)消化液: 0.125%胰蛋白酶和0.01%EDTA(1:1,V/V)混合消化液。
3.培养基配方和制备DMEM或M199,添加20% FBS,3.5g/L葡萄糖、2mmol/L谷氨酰胺、1 mmol/L丙酮酸钠、100U/ml青霉素和100 ug/ml链霉素。
4.实验器材眼科剪、眼科镊、手术刀、解剖剪、解剖镊和止血钳、培养皿或培养板。
【方法】
1.取材用75%乙醇消毒胎儿胸部和腹部,切开胸壁和腹壁。取胸主动脉或腹主动脉,放入预冷的HBSS中,在解剖显微镜下剥除动脉外膜的纤维组织和脂肪。用HBSS冲洗血管腔,去除血液。在盛有HBSS的培养皿中,纵向剪开血管壁,然后冲洗。
2.消化在另一培养皿中加入少量的消化液,使血管内膜面朝下,铺在消化液上。在37℃条件下,消化10~15分钟。然后,再加入含20% FBS的培养液,终止消化。
3.分离细胞将血管壁移入到另外一个培养皿中,用手术刀轻轻刮取血管内皮细胞后,用培养液收集内皮细胞,进行1000r/min离心10分钟,也可用培养液直接将刮下的内皮细胞收集到培养皿中,进行培养。
4.接种与培养弃去上清液,用培养液混悬细胞沉淀,进行细胞计数,将细胞密度调整至1.5x105个/ml,接种在细胞培养皿或培养板中。培养24小时后,吸去培养液,用HBSS浸洗1次。然后,加入培养液继续培养,每隔2~3天更换培养液1次。当细胞生长形成单层时,进行传代培养。
【结果】
培养30分钟后,血管内皮细胞贴壁。培养1周后,细胞生长形成单层,呈卵石状排列。
【注意要点】
1.刮取内皮细胞时,不要过深刮取或刮至血管断面处,以免引起纤维细胞的污染与混入。
2.培养皿中的消化液不宜过多,避免引起血管内皮以外的其他各层组织的消化与污染。
3.如果分离的细胞量过少,接种细胞不会生长汇合时,可以在培养基中加肝素或促分裂原进行处理。
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