人脂肪细胞（adipocyte）是非常好的研究对象。它们是正常细胞，常用来自大网膜脂肪组织或皮下结缔组织培养。在特殊培养条件下，它们不增殖，能分化成类似成熟的脂肪细胞。在无血清培养液中，前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞，能生长增殖、汇合，并可传代。常用前脂肪细胞（preadipocyte）原代培养法来研究脂肪细胞的发育。

【材料】

1．组织来源腹股沟区皮下或腹膜后的脂肪组织。

2．培养用试剂

(1）清洗液：HBSS，不含Ca²⁺, Mg²⁺和酚磺酞，加入100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素。

(2）消化液：Trypson/EDTA,0.05％胰蛋白酶，0.53 mmol EDTA ; Ⅱ型胶原酶，配成1 mg/ml HBSS液。

(3)溶解红细胞缓冲液10mmol KHC0₃,0.1 mmol EDTA,0.154mol NH4Cl，溶于去离子蒸馏水中。

(4）分化液

1）分化液（EDTA/F12+)：DMEM/F12添加15mmol HEPES,15mmol NaHC0₃,33umol生物素、0.5 umol胰岛素17 umol泛酸（pantothenic acid),0.2nmol三碘甲状腺原氨酸（triiodo-thyronine) ,0.1umol地塞米松（dexamethasone) ,50U/ml青霉素、50ug/ml硫酸链霉素。

2）地塞米松：制备5 mmol的EtOH干液，储存于-20℃中，稀释成10-5 mol的DMEM/F12的稀释液，使用时加入至1.Oml/l00ml的DMEM/Fl2。

3)三碘甲状腺原氨酸：制备蒸馏水配0.2mmol干液（106x终浓度）保存于-20℃，用DMEM/F12稀释成1/1000，然后加入100u1/100ml DMEM/F12。

4）泛酸：制备1000x最终浓度（17 mmol )蒸馏水配的使用液，分装成每0.5m1等分，保存于-20℃，使用时加入至1.Oml/l00m1的DMEM/F12,

5) DMEM/Fl2;1:1; DMEM的混合物和Ham补有F12营养混合物，含15 mmol NaHC0₃,15mmol HEPES,50U/ml青霉素和50ug/ml硫酸链霉素。

通过0.22 um滤膜过滤上述所有液体。

3．培养基配方和制备Dulbecco改良Eagle培养液（100mg/L葡萄糖，无酚磺酞）添加44mmol NaHC0₃,10％热灭活的胎牛血清、50U/ml青霉素、50ug/ml硫酸链霉素。

4．实验器材手术刀、解剖剪、解剖镊和止血钳。孔径为250um和20～30 um大小的尼龙网。

【方法】

1．取材外科手术时获取脂肪组织，置于无菌的HBSS中，最好于获得后立即进行切割。切割黄色脂肪组织，尽可能不含血管和白色结缔组织，用尖刀剪碎成大小约lmm²小块。

2．消化把剪碎的组织块转入瓶口大一些的瓶中，加胶原酶（按1体积的组织加入4体积的胶原酶）。置37℃孵箱中摇动消化30分钟，把消化成糊状的脂肪组织通过消毒的250 um尼龙纱网滤过入50ml离心管中。室温条件下离心进行1500r/min离心10分钟。

3．分离细胞弃去漂浮的脂肪块和上清液，在沉淀上留少量液体，约0.5ml左右。用吸管轻轻吹吸，制成细胞悬液，倒入1个或数个消毒的新离心管中。向每个管中加20ml红细胞溶解缓冲液，室温条件下静置10分钟。通过20～30 um尼龙网滤入干净的无菌离心管中，进行300r/min离心30分钟，以除去内混杂的内皮细胞。弃去上清液，用20m1 HBSS漂洗细胞沉淀。

4．接种与培养把细胞沉淀重悬于DMEM/10% CFS培养液中，然后把细胞接种于适当的培养皿或培养瓶中，进行细胞计数，调整细胞密度为(0.5～1)x10⁵个／ml; 50g切碎的组织能产生足够12个25cm²培养瓶，4个75cm²培养瓶，或6个6孔培养板之用。置37℃,5% co₂ ,100％的湿度的培养箱中培养24小时后，弃去培养液，用HBSS洗2次，以除去未附着的细胞，重新加入新鲜的DMEM/10％培养液。每隔2～3天更换一次液体。根据接种时细胞的密度，约10～15天内可汇合，脂肪间质细胞在培养中的倍增时间，约为3天。弃去培养液后，可先用HBSS漂洗一次，然后加胰蛋白酶／EDTA液室温处理5分钟，即使细胞脱离贴附。然后按1:5稀释接种于DMEM/10% CFS培养液中。如果是为研究膜特性或细胞表面受体，则需用消毒和无毒性的柔软小橡胶刮，采用轻轻刮取的方法。由于胰蛋白酶对上述结构有不利影响，因此不采用胰蛋白酶消化法。

5．诱导细胞分化接种20小时后，需把培养液更换成不含血清的分化培养液。前脂肪细胞在含有血清的培养基中超过24小时，会干扰细胞分化。用HBSS浸洗细胞3次，一定不要残留血清，然后加入分化培养基（DMEM/Fl2+)。在不含血清的培养基中，细胞需要7～9天才能发生分化，15～21天达到最大分化程度，每隔2～3天，更换一次分化培养基。

【结果】

在培养初期，脂肪细胞的形态似成纤维细胞。细胞成片时，细胞逐渐增大和变圆，形成成熟的脂肪细胞。培养4天左右开始出现脂滴，7～10天脂滴最多。

【注意要点】

1．取材时仔细剥除脂肪组织的血管和结缔组织。可用胶原或明胶处理培养皿底壁，以利于脂肪细胞贴壁生长。

2．大多培养基中含有酚磺酞指示剂，它具有诱生雌激素的性质，因此研究雄激素／雌激素代谢时，不应含有酚磺酞。

3．能够发生分化和积累脂肪滴的细胞，随来源不同，变动性很大；为最大限度使前脂肪细胞分化，接种的密度越大越好。

4．人前脂肪细胞初代培养时，在含有血清的培养基中培养24小时后，已不能再诱发分化。脂肪间质细胞可用胰蛋白酶消化传代6～7次，细胞仍维持成纤维细胞状态。