肌组织具有伸缩能力，由肌组织细胞组成。细胞细长呈纤维状，一个肌细胞即一根肌纤维。依据肌细胞的形态结构、功能和分布，将其分为三类：平滑肌、骨骼肌和心肌。平滑肌细胞一般呈梭形，无横纹，收缩力较弱，不易疲劳，分布于血管的管壁及某些内脏器官。骨骼肌细胞具有横纹，收缩力强，易疲劳，主要附着在骨骼上，细胞呈梯形。心肌细胞的结构特征与骨骼肌的结构基本相似，也有横纹，细胞呈短柱状，有分支，细胞连接处有闰盘，收缩有自动节律性，主要存在于心脏和接近心脏的大血管近段，细胞呈圆柱状。这三种肌肉细胞的基本培养方法有许多相似之处。

一、血管平滑肌细胞培养

血管壁从管腔面向外一般依次可分为内膜、中膜与外膜三层。内膜是管壁的最内层，由内皮和内皮下层组成，是三层中最薄的一层；中膜由平滑肌、弹性纤维和胶原纤维组成；外膜由疏松结缔组织组成，其中含螺旋状或纵向分布的弹性纤维和胶原纤维。当除去血管内皮和外膜的结缔组织之后，则剩余组织的细胞成分只有平滑肌细胞。在一定条件下细胞可持续存活与生长，并保持在体血管平滑肌细胞的某些特性。血管平滑肌细胞的原代培养可以为研究其形态、功能及其在组织工程血管中所起的作用提供物质基础，具有重要意义。

【材料】

1．组织来源人胚和成人的血管均可用于组织培养。取材部位根据实验所需有胸主动脉、降主动脉、肺血管、脑血管、脐血管和肠系膜血管等。

2．培养用试剂

（1）Hanks液。

(2) 0.15％胰蛋白酶液：胰蛋白酶溶于不含Ca²⁺和Mg²⁺的CMF-PBS中，pH 7.4。

(3) 0.1％胶原酶。

3．培养基配方和制备Dulbecco基本培养基（DMEM）补加10％～20％浓度灭活的胎牛血清（原代培养时加20%，传代培养时加10%）,2mmol/L L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素。

4．实验器材平皿、眼科镊,120目细胞筛、剪刀、培养瓶和离心管。

【方法】

1．分散细胞原代培养法

(1)取材：在无菌条件下取出所需血管，并在Hanks液中反复冲洗，去除残留血液。将动脉切成2.5～3.Ocm长的小段，放入盛有培养液的平皿中剥离外膜。

用眼科剪纵行剪开动脉，使内膜向上平铺于培养皿上，以圆钝的镊子或剪刀背轻轻刮除内膜面，以去除内皮细胞。用含青、链霉素的Hanks液反复冲洗，去除杂质及可能残留的内皮细胞和外膜成纤维细胞，然后将一次取材的2～3条血管的中膜组织混合在一起，置于无菌培养皿中。滴加少许培养液使组织保持湿润，用眼科弯剪反复剪切成lmmxlmm大小的组织块备用。

(2）消化：将动脉中层组织块置于10ml链霉素瓶中，加入0.1％胶原酶溶液，在37℃恒温箱中作用1～3小时，至组织呈絮状，立即加入血清终止消化。

(3)分离细胞：将玻璃培养瓶置于37℃空气摇床振摇10分钟，继续用吹打的方法使组织块表面的细胞尽可能脱落。待细胞从组织块脱离后，用120目细胞筛过滤，转入离心管内离心，弃上清液，用培养液吹打细胞，即可得到分散的平滑肌细胞；若还剩有组织块，可用胰蛋白酶溶液同法再消化1次。

(4)接种与培养：将所得到细胞悬液调节细胞密度为5x10⁴～5x10⁵/ml，接种于培养瓶中。在37℃,5% CO₂细胞培养箱中培养。每3天换液1次。

2．植块培养法用眼科镊将小块组织移入培养瓶中，小块间相距约0.5cm为宜。加入含20％胎牛血清的培养液，塞紧瓶口。将贴有组织块的一侧朝上，使其不与培养液接触，置于37℃,5% C0₂细胞培养箱中静置使小块微干涸。2～5小时后轻轻翻转培养瓶，使植块浸入培养液中。继续静置培养。每3天换液1次。一般在4～7天后方可见到细胞从组织块边缘长出;2～3周出现致密的细胞层。待细胞长满培养瓶底面积80％后用0.25％的胰酶消化传代。

【结果】

一般培养18小时后细胞即已贴壁。倒置显微镜下观察，培养5～8天可见少量细胞以垂直方向自组织块边缘游出，渐向外生长形成细胞晕，进而形成细胞簇，且形态多样（梭形、多角形、星形或不规则形），大小略有差异。培养第12天细胞进入对数生长期，细胞呈梭形，平行生长，束状排列，密集与稀疏处相互交错呈“峰谷”状，峰处为多层的细胞，谷处没有细胞或仅1一3层细胞。这易与成纤维细胞表现为“同心圆”状的生长形式相区别。培养约2周左右细胞融合成片，甚至相互交叉生长形成多层，可以进行传代培养。电子显微镜下观察，细胞内有一个卵圆形或腊肠形的细胞核，核中包含2个或2个以上的核仁，细胞质中主要为特征性的肌丝，呈束状排列，与细胞长轴平行，肌束之间可见密体，细胞膜附近有时可见平滑肌细胞特有的密斑和吞饮小泡。

【注意事项】

1．取材时应注意勿牵拉，用力牵拉将破坏平滑肌细胞。一般受牵拉少，剪切时边缘整齐、圆滑的组织块萌出细胞的几率较大。培养过程中很容易污染，除操作上注意减少污染机会外，在培养基中加入青霉素和链霉素可以起到一定的预防作用。

2．将剪成lmmxlmm左右的小组织块贴附于培养瓶底，以0.5cm左右的间距将组织块均匀分布于培养瓶底部后垂直放置于细胞培养箱中，待组织块干涸并与瓶底贴壁附着后2小时以内，将培养瓶慢慢翻转平放再添加培养液可增加组织贴壁率。

3．换液时选择1/2或2/3换液以维持培养液的酸碱环境，不致因为pH的改变而引起细胞死亡。

4．细胞传代时，酶消化时间不应固定或硬搬他人经验，应在镜下观察，至胞质回缩，间隙增大时及时终止消化。

5．影响血管平滑肌细胞增殖的因素

(1)生长刺激因素：能够刺激血管平滑肌细胞生长的因素很多，包括血小板源性生长因子（PDGF )、内皮细胞生长因子（EGF)、凝血酶和Ca²⁺、Cd²⁺、Pb²⁺等。其中，以PDGF作用最大，它是血清中主要的生长刺激因子。

(2）抑制因素：肝素在平滑肌细胞分布中可能起重要作用。肝素及其类似物能维持离体平滑肌细胞在“收缩型”状态，使其不能对血清刺激起反应，也可抑制“合成型”平滑肌细胞的增殖。