乳腺主要由腺上皮组成，是乳腺中唯一具有分泌功能的细胞，体外原代培养可获纯乳腺上皮细胞，该上皮细胞仍具有二倍体遗传特性，具有乳腺细胞的功能，是研究人和动物正常乳腺细胞增殖分化、细胞间的信息传递和乳腺癌细胞的重要材料。乳腺材料易于获得，既可培养正常乳腺，也可利用乳腺癌组织。乳腺不难培养，是很好的培养和研究对象。乳腺上皮细胞的培养方法主要有组织块法、酶消化法、机械法及从初乳中分离乳腺上皮细胞。

一、乳腺组织培养

乳腺初代培养，应用胶原酶消化最好；以人胚胎肠管上皮细胞作饲养层，培养的人单层乳腺上皮细胞，可抑制正常间质细胞和肿瘤细胞的污染，优化培养基。

【材料】

1．组织来源乳腺切除组织或乳腺成形术时组织取材，避开病变组织和可疑组织，取正常乳腺组织。

2．培养用试剂

（1）不含Ca²⁺和Mg²⁺的CMF-Hanks液，pH 7.4。

(2）胶原酶、蛋白酶。

3．培养基配方和制备培养液RPMI 1640培养液，添加10% FCS,100U/ml青霉素和l00 ug/ml链霉素。

4．实验器材各种吸管、试管、离心管（15ml,50ml )、培养瓶、培养皿、手术刀、解剖剪、解剖镊、眼科剪，眼科镊和孔径150 um的过滤筛网。

【方法】

1．取材预先把无菌容器送交手术室，选脂肪少、腺组织多的部位，切取少许，立即放入洗涤液中，用冰块转移到实验室并在1小时内立即进行培养。获取组织后，用高压灭菌的手术刀和镊子，从样本中小心地剥除脂肪组织。

2．接种与培养

(1)直接培养法：在含有少量培养液或CMF-Hanks液的容器中，用锋利刀片将组织反复切割成碎块，然后将组织碎块样本放在含有5～lOml新鲜培养液的l0ml离心管中，用吸管吹打片刻，室温培养10分钟。此时乳腺细胞团或单个细胞大多沉降至管底，而脂肪或其他含纤维多的碎块悬于液体上部；吸除上层液，可排除非腺细胞成分，重复洗涤两次以上。对于较大的组织标本，用50ml的离心管及更多的培养液以确保能够充分的洗涤。末次处理结束后，向沉降管中再补加培养液，用吸管稍吹打，使沉降物重悬，然后不待细胞团块下降，立即通过3～4层无菌纱布滤入试管中。调整好适宜密度，接种入培养瓶中培养。

(2)胶原酶消化法：用剪刀将组织切成直径为0.5 mm²左右的碎片。将组织碎片浸入酶溶液，置37℃条件下，磁力搅拌器作用30分钟。消化后轻轻地吹打细胞，以含10％胎牛血清的培养液终止消化。用过滤网过滤液体收集细胞，去除脂肪层和较大的未解离的组织，混悬液进行1000r/min离心8分钟，去上清液；用培养液重悬细胞团块，1000r/min离心8分钟，重复洗涤3次。小心收集细胞，用培养液制成细胞悬液。细胞计数，然后将细胞接种于培养瓶中，活细胞密度在(2.5～5)x10⁵个／瓶左右。在37℃,5% C0₂细胞培养箱中培养48小时；每2天更换1次培养液。未消化的组织重复消化30分钟，以获得额外的细胞。

【结果】

接种后第1天的细胞形态与接种当时没有明显差别，但是轻轻晃一下培养瓶可以看到大多数细胞已经在培养瓶瓶底贴壁，不随培养液移动。细胞密度较低时，呈岛屿状聚集生长，并有接触抑制现象。接种第3天可以看到少数细胞在瓶底展开，细胞呈扁平的多角形，胞质近中央处有圆形的细胞核，大多数细胞仍未展开。接种第5天可见细胞团块周围有大量细胞迁出，围绕细胞团块成片生长，细胞之间排列紧密，相互衔接，连接成片生长，呈典型的“铺路石”状。接种第7天可见细胞生长扩大，肉眼可见细胞“生长晕”，镜下见细胞团块周围细胞生长旺盛，细胞密集，外围细胞呈典型的上皮细胞形态；细胞生长旺盛的状态可持续3周左右，此后细胞生长趋缓，部分细胞甚至出现异常形态。

电镜下见细胞游离面有密集的微绒毛，胞质中可见丰富的线粒体、高尔基复合体、粗面内质网，细胞与细胞间可见到紧密连接、中间连接、桥粒和缝隙连接。

【注意事项】

1．组织块培养法操作过程简单，但培养所需时间较长，一般成纤维细胞3一4天最先长出，上皮细胞要培养7～8天才能出现。国外近年来的培养方法多采用胶原酶、透明质酸酶等酶消化法，使用的胶原酶主要有Ⅰ,Ⅱ,Ⅳ型胶原酶。

2．在初代培养成功后，为进一步获取乳腺细胞培养的成功，主要需解决刺激乳腺细胞持续生长问题。只有旺盛的细胞生长，才能压制成纤维细胞，获得纯上皮细胞培养物。开始有巨噬细胞存在，可作滋养细胞，随着上皮细胞的生长和克隆形成，巨噬细胞逐渐消失。培养基中也可加刺激生长因子如EGF,胰岛素、氢化可的松和前列腺素El等，有利于细胞生长繁殖。

3．如果标本中纤维组织较多，可用胶原酶消化法制备细胞。

二、从乳汁中分离乳腺细胞培养

乳腺组织培养一般利用外科手术来源的乳腺组织，但也可从乳汁中分离乳腺细胞进行培养。早期乳汁或断奶后的乳汁含有上皮细胞团块，可用离心法收集上皮细胞（混杂有巨噬细胞）。生长在补加含有激素和人血清培养液中的初代培养，能形成生存期有限的细胞系，但却具有生成克隆的能力。这些细胞系最后能被非上皮性“晚期”乳腺细胞所覆盖。乳腺细胞培养对外科再建乳房有很大实用价值。

【材料】

1．组织来源产后2～7天产妇的乳汁。

2．培养用试剂

（1)胎牛血清。

(2）人血清（HBsAg阴性）。

(3)胰岛素，1 mg/ml（用6mmol/L盐酸配制）。

(4)氢化可的松，生理盐水配制0.5 mg/ml。

(5)霍乱毒素，生理盐水配制50 ug/ml。

(6) EDTA;4ml，用PBSA配制7mmol/L。

(7）胰蛋白酶液：HBSS配制1% 2ml。

其中，血清和储存备用的胰岛素、氢化可的松、霍乱毒素、胰酶和胰蛋白酶等的干液，应在-20℃条件下保存。

3．培养基配方和制备RPMI 1640含有15% FBS,10％人血清、50ug/ml霍乱毒素、0.5 ug/ml氢化可的松和1 ug/ml胰岛素。

4．实验器材培养瓶、培养皿和离心管。

【方法】

1．取材于产后2～7天在病房收集产妇的乳汁，用无菌水擦洗乳头及乳晕，用手挤压乳房使乳汁流入无菌容器，开头的少许乳汁弃掉，随后每人可向瓶中收集10～20ml乳汁，加1：1的培养基进行稀释，离心。

2．分离细胞以1000～1500r/min离心20分钟，仔细去除上清液，留少许脂肪，以避免搅动下方沉积。用培养基清洗细胞2～4次，直至上清液不浑浊为止。用3～5 ml培养基将离心洗涤的细胞沉淀制成细胞悬液。

3．接种与培养将细胞悬液接种培养瓶（培养皿或培养板）中，置于37℃,5% CO₂细胞培养箱中培养。3～5天更换培养基，换液2次后大约6～8天可见小的细胞克隆形成，并且扩大，开始可见有滋养作用的巨噬细胞，随后细胞克隆将周围乳汁巨噬细胞向外推，以后逐渐消失。细胞长满底壁80％～85％时，用0.2％胰蛋白酶消化5～10分钟，洗去消化液，以1：3比例分瓶传代培养。