神经干细胞（neural stem cells, NSCs）是一种具有自我更新及广泛分化潜能的细胞，它处于分化的非终末状态，可通过对称或不对称分裂出新的干细胞或分化潜能逐渐变小的子细胞，最终产生中枢神经系统的三种主要细胞，即神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞。采用无血清培养和单细胞克隆法可从人胚脑皮层中分离得到具有自我更新和多分化潜能的神经干细胞，并采用免疫荧光染色对其进行鉴定。

【材料】

1．组织来源胚龄10周自然流产的人胚胎。

2．培养用试剂

（1）无钙镁PBS (CMF-PBS )。

(2）消化液：0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA混合消化液。

3．培养基配方和制备

（1)人胚脑组织干细胞培养液：DMEM/F12 (1：1)无血清培养基，含有2% B27,20ng/ml表皮细胞生长因子（epidermal growth factor, EGF) ,20ng/ml bFGF。

(2）人胚脑组织干细胞诱导培养液：添加20％胎牛血清的DMEM/Fl2 (1：1)。

4．实验器材眼科直剪、眼科直镊、眼科弯镊、玻璃平皿、200目尼龙滤网、50ml和15ml离心管、手术刀片。

【方法】

1．取材无菌条件下分离出胚胎大脑皮质组织，剥除脑膜及表面血管，在PBS液中漂洗3次。在含有DMEM/F12的培养液中，用眼科剪将其充分剪碎。

2．消化用0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA混合消化液消化细胞团5分钟，吸管将细胞团打散，加入含10% FBS的培养液终止反应。

3．分离细胞将细胞悬液移入离心管中，1000r/min离心5分钟，弃上清液。用巴斯德吸管反复吹打组织碎块至完全散开，离心洗涤后吹打制成细胞悬液，经100目不锈钢滤网过滤，制成单细胞悬液。

4．接种与培养细胞计数，将细胞以2x10⁶/ml密度接种至培养板上。置37℃,5% C0₂饱和湿度的孵箱中培养。直至NSCs增殖形成神经球后再换液。首次传代后每3天半量换液。

5．传代培养及单细胞克隆采用有限稀释法，将原代细胞以及2周后的传代细胞制成的单细胞悬液，于％孔培养板中滴加稀释的细胞悬液，每孔100ul，选取仅有一个细胞的培养孔作标记，并动态观察。待1个细胞长成单细胞克隆球后再次机械分离成单细胞悬液，所有细胞接种至培养瓶中，待克隆形成后连续传代，最后得到来自单个细胞的克隆球。

6．克隆诱导分化选取单细胞形成的克隆球，接种于培养皿中（预先铺有多聚赖氨酸包被的玻片），用含血清培养基诱导NSCs，在12小时、2天、7天、14天进行巢蛋白（nestin) ,微管相关蛋白（microtubule-associated protein-2, MAP-2）及胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）免疫荧光检测。

【结果】

细胞接种于培养皿后24小时，可见细胞散在分布，生长晕明显，接种后3～4天，可见大小不等的细胞团，即克隆球形成，散在分布。球体边界较清晰，折光性强，细胞内部有颗粒状结构。体外培养的NSCs呈神经球样生长，免疫荧光染色结果显示，细胞nestin表达均为阳性。添加20％胎牛血清的NSCs诱导培养液中培养，诱导24小时后，球体边缘处细胞伸出突起进入分化状态，细胞生长旺盛，可见不同形态的细胞从细胞团边缘长出。

【注意事项】

1．控制胰蛋白酶作用时间。

2．用添加20％胎牛血清的培养液作为NSCs诱导培养液，可以诱导神经干细胞向神经元和神经胶质细胞方向分化。